阿司匹林对兔颊VX-2鳞状细胞癌炎症微环境中树突细胞的影响

陈志红  黄桂林  张霓霓  易杰  姚礼  张林.贵州省人民医院口腔科，贵阳 55000；.遵义医学院附属口腔医院口腔颌面外科，遵义 563000



阿司匹林对兔颊VX-2鳞状细胞癌炎症微环境中树突细胞的影响

陈志红1黄桂林2张霓霓2易杰2姚礼2张林2
1.贵州省人民医院口腔科，贵阳 550002；2.遵义医学院附属口腔医院口腔颌面外科，遵义 563000

[摘要]目的 探索阿司匹林及炎症对兔颊VX-2鳞状细胞癌上清液中树突细胞（DC）成熟及功能的影响。方法 通过瘤粒植入术及机械创伤+高糖饮食的方法，建立兔颊VX-2鳞状细胞癌及其炎症模型，将模型兔分为3组。实验组：制造颊癌及炎症后使用阿司匹林灌胃治疗3 d；对照组：制造颊癌及炎症后以生理盐水灌胃作为对照；空白组：不制造炎症的单纯肿瘤兔组。3 d后收集各组肿瘤标本，制成匀浆，取上清液与正常兔外周血单核细胞共培养以使其向DC分化，采用流式细胞仪检测DC表面分子CD83、CD86、人类白细胞DR抗原（HLA-DR）的表达，混合淋巴细胞反应检测DC刺激T细胞增殖的能力。结果 实验组和对照组中CD83、CD86、HLA-DR阳性率均低于空白组（P< 0.05），而实验组和对照组间的差异无统计学意义（P>0.05）；同样，实验组和对照组刺激T细胞增殖的能力弱于空白组（P<0.05），而两组间刺激T细胞增殖的能力无明显差异（P>0.05）。结论 炎症可抑制DC表面分子CD83、CD86、HLA-DR的表达和功能发挥，短期、小剂量服用阿司匹林对兔颊VX-2鳞状细胞癌炎症微环境中DC的表型改善和功能发挥无明显作用。

[关键词]阿司匹林； 炎症； VX-2鳞状细胞癌； 树突细胞

口腔鳞状细胞癌是一种常见的口腔颌面部恶性肿瘤，在全球范围内其发病率呈现出不断上升的趋势[1]。阿司匹林是一种非甾体类解热镇痛抗炎药，已有研究[2-5]发现该药物在抑制一些伴有炎症的恶性肿瘤发生、发展、转移及复发中起重要作用。口腔是一个污染环境，肿瘤局部常常伴有感染性炎症，但目前关于阿司匹林在口腔鳞状细胞癌中作用的研究较少。本研究应用阿司匹林治疗兔颊VX-2鳞状细胞癌的局部炎症，检测代表树突细胞（dendritic cells，DC）成熟及功能的表面分子CD83、CD86、人类白细胞DR抗原（human leukocyte antigen-DR，HLADR）的表达及DC刺激T细胞增殖的能力。

1  材料和方法

1.1  VX-2鳞状细胞癌的来源

VX-2鳞状细胞癌的荷瘤兔购自中山大学，为种植在新西兰兔后腿的VX-2瘤块。

1.2  实验动物

25只2～4月龄新西兰大白兔，质量1.5～2.0 kg，雌雄随机，购自重庆滕鑫生物技术有限公司。

1.3  主要实验试剂

阿司匹林肠溶片（山东鲁抗辰欣药业股份有限公司）；兔外周血淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限公司），FITC-HLA-DR、FITC-IgG2a、APC-CD83、APC-IgG1、PE-CD86、PE-IgG1抗体（BD公司，美国）；尼龙毛（郑州派和泰德医药科技有限公司）；活细胞计数试剂盒（日本同仁化学研究所）。

1.4  实验方法

1.4.1  兔颊VX-2鳞状细胞癌及其炎症模型的建立  参考田军等[6]的建模方法，切取荷瘤兔的VX-2肿瘤制备成大小约1 mm3的瘤粒，植入到实验兔颊肌内，6~ 7 d可扪及肿瘤形成。第14天，参考张林等[7]的方法建立炎症模型。在肿瘤表面切除一块长宽厚分别约为1、1、0.3 cm的黏膜，术后全部实验兔以高糖黏性牛奶（白砂糖、水、纯牛奶的质量比为20∶30∶50）替代普通饮水。第17天，可见肿瘤表面破溃糜烂并伴有腐臭味，提示建模成功。

1.4.2   实验动物的干预   实验组（VX-2肿瘤+炎症+阿司匹林组）：选取6只肿瘤伴炎症模型兔，第17天开始给予阿司匹林片（剂量10 mg·kg-1）灌胃。对照组（VX-2肿瘤+炎症组）：6只肿瘤伴炎症模型兔，第17天开始给予20 mL生理盐水灌胃。空白组（单纯肿瘤组）：6只单纯VX-2肿瘤兔，第17天开始给予20 mL生理盐水灌胃。各组均每天灌胃1次，连续3 d。

1.4.3  肿瘤组织的病理学观察  实验第20天，完整切取各组实验兔的颊部肿瘤，然后处死动物。部分标本放入10%甲醛固定液中固定，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，置于光镜下观察各组标本的组织学形态。其余标本按200 g·L-1的质量浓度与无血清RPMI 1640培养基混合，制成匀浆，3 000 r·min-1离心20 min，重复离心2次，取上清液保存于-20 ℃冰箱内备用。

1.4.4  兔外周血单核细胞的分离  取正常新西兰大白兔1只，通过心脏穿刺采血15 mL，按淋巴细胞分离液说明书分离外周血单核细胞。调整细胞密度为2× 106·mL-1，以每孔1 mL的体积加入6孔培养板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养3 h，吸弃上清液，剩余细胞即为单核细胞。将1.4.3中所得上清液用0.22 μm过滤器过滤除菌3遍，然后与单核细胞共培养，并依此分为3组。1）实验组：每孔加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基2 mL，添加1 mL肿瘤+炎症+阿司匹林组上清液。2）对照组：每孔加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基2 mL，添加1 mL肿瘤+炎症组上清液。3）空白组：每孔加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基2 mL，添加1 mL单纯肿瘤组上清液。

每组隔日半量换液，细胞培养至第6天，收集各组细胞，采用流式细胞仪检测DC表面分子CD83、CD86、HLA-DR的表达，收集部分细胞在扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）下观察细胞形态。其余的各组细胞进一步行混合淋巴细胞反应。

1.4.5  流式细胞仪检测CD83、CD86、HLA-DR的表达  将各组细胞制备成为单细胞悬液，密度为1× 106·mL-1，活细胞率>95%。将实验组、对照组、空白组的每组取6个样本，每个样本分别设2个加样管，即实验管（100 μL细胞悬液，加入10 μL CD83-APC+ 10 μL CD86-PE+10 μL HLA-DR-FITC）和对照管（100 μL细胞悬液，加入10 μL IgG1-APC+10 μLIgG1-PE+10 μL IgG2a-FITC），室温条件下避光孵育20 min。孵育结束后，1 500 r·min-1离心10 min，弃上清液，PBS清洗2次，加0.5 mL PBS混匀，然后加0.5 mL 1%多聚甲醛固定，4 ℃冰箱避光保存，采用流式细胞仪检测CD83、CD86、HLA-DR的表达情况。

1.4.6  T细胞的分离（尼龙毛柱法）及混合淋巴细胞反应   按1.4.4的方法分离外周血单核细胞，细胞培养箱中静置3 h，轻轻吸取悬浮细胞备用。按照说明书分离T细胞，调整细胞密度为5×106·mL-1。各组加入25 mg·L-1丝裂霉素C，37 ℃、5%CO2培养箱中处理30 min，PBS清洗3遍，悬于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，调整细胞密度为1×106·mL-1。分别以实验组、对照组、空白组DC作为刺激细胞，T细胞为效应细胞，另设阴性对照组（只添加T细胞）和单纯培养液对照组。将DC和T细胞以1∶10的比例，每组3个复孔，置于96孔板混合，终体积 200 μL。置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育72 h，然后每孔加入活细胞计数试剂盒试剂20 μL，继续孵育3 h。采用酶标仪于450 nm波长处检测各组的吸光度A值并计算刺激指数（stimulation index，SI），SI=（待测样品孔A值-单纯培养液对照组A值）/（阴性对照组A 值-单纯培养液对照组A值）。

1.5  统计学处理

应用SPSS 21.0软件进行分析，3组间各指标的比较使用方差分析，两两比较使用LSD检验，检验水准为双侧α=0.05。

2  结果

2.1  兔颊VX-2鳞状细胞癌及其炎症模型的肉眼及病

理学改变

在炎症制造后第3天（实验第17天），肉眼观可见实验组和对照组瘤兔的肿瘤外露，组织红肿、渗血，其中对照组的渗血及红肿更为严重；空白组颊部肿瘤表面黏膜完整，未见明显破溃（图1上）。镜光下观察可见各组肿瘤组织异型性明显，有大量大小和形态不一的癌细胞。实验组和对照组中有较多炎症细胞浸润，而空白组炎症细胞浸润较少（图1下）。

图 1  3组兔颊VX-2鳞状细胞癌的形态及病理学改变Fig 1  Morphological and pathological changes of rabbit buccal VX-2 squamous cell carcinoma of three groups

2.2  DC的形态

细胞培养第6天，在倒置显微镜下观察可见，部分DC呈悬浮或半悬浮状态生长，并且聚集成团，细胞呈不规则形（图2左）；SEM下可见，DC表面粗糙不平，有大量褶皱及长短、粗细不等的树突样突起（图2右）。

2.3  各组兔外周血源DC表型的流式细胞学检测

各组兔外周血源DC表型的流式细胞学检测结果见表1。将3组CD83、CD86和HLA-DR的表达情况进行方差分析，各组CD83、 CD86和HLA-DR阳性率的差异有统计学意义（F值分别为41.003、65.099、27.199，P值均小于0.01）。进一步行LSD两两比较，CD83、CD86和HLA-DR阳性率在空白组和实验组之间的差异有统计学意义（P<0.01），空白组大于实验组，而实验组和对照组之间阳性率的差异均无统计学意义（P>0.05）。

图 2  培养第6天DC的形态Fig 2  Morphology of DC on the sixth day of cell culture

表  1 3组CD83、CD86和HLA-DR的表达Tab 1 The expression of CD83 , CD86 and HLA-DR of three groups

2.4  混合淋巴细胞反应

实验组、对照组、空白组经混合淋巴细胞反应检测，其刺激T细胞增殖能力SI的结果分别为1.547± 0.049、1.553±0.057、1.741±0.028，经方差分析，3组间SI的差异有统计学意义（F=32.894，P<0.05）。进一步行LSD两两比较，实验组DC刺激T细胞增殖的能力较空白组弱，两组间的差异具有统计学意义（P<0.01），而实验组与对照组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。

3  讨论

目前认为，阿司匹林可通过环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）依赖途径和COX-2非依赖途径发挥抗肿瘤作用[8]。COX-2是一种炎症因子，在肿瘤炎症微环境中可通过促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤血管生成，参与肿瘤侵袭及免疫抑制等机制发挥作用[9]。其中，免疫抑制就涉及DC，DC是迄今为止发现的功能最强大且唯一能激活原始T细胞的抗原提呈细胞，而在肿瘤炎症微环境中，由于受多种炎症细胞及炎症因子的作用，DC发生表型缺陷，无法有效提呈肿瘤抗原，从而导致免疫缺陷的发生[10-12]；因此，从理论意义上来说，阿司匹林可通过抑制COX-2活性，减少前列腺素释放，减轻肿瘤炎症微环境的炎症，促进DC表型改善，从而发挥抗肿瘤作用。张洪涛等[13]将应用COX-2抑制剂塞来昔布预处理的C6细胞上清液与外周血单核细胞共培养，培养第10天收集DC，检测表面分子CDla、CD80、CD83、CD86的表达情况，并行混合淋巴细胞反应检测DC的功能状态，结果发现：各组DC表面分子CDla、CD83的表达差异无统计学意义，单纯C6细胞上清液组中CD80、CD86的表达低于塞来昔布处理组，差异有统计学意义，与之相应的刺激T淋巴细胞增殖的能力也降低；由此得出结论认为，通过抑制COX-2的活性可降低肿瘤局部微环境中前列腺素-2的水平，塞来昔布可促进DC的表型改善和功能发挥。

在本实验中，首先建立兔颊VX-2鳞状细胞癌及其炎症模型，通过肉眼和镜下观察各组实验兔局部炎症轻重，在连续3 d使用阿司匹林后，肉眼观察可见实验组肿瘤表面红肿、溃烂情况较对照组稍有好转，镜下观察见肿瘤组织内炎症细胞浸润无明显减少，实验组中DC表面分子CD83、CD86、HLA-DR较对照组稍有升高，但差异无统计学意义，而与空白组相比，仍明显降低，具有统计学意义。同样地，实验组刺激T细胞增殖的能力也无统计学意义，这与张洪涛等[13]的研究结果不完全一致。笔者推测可能的原因为：首先，阿司匹林为抗炎药物，实验兔肿瘤局部伴有感染，阿司匹林并不具有抗感染作用，因此，不能从病因上减轻肿瘤局部炎症；其次，早有研究[14]发现，长期服用阿司匹林可使癌症发病率或死亡率降低40%，近年Rothwell等[15]和Bastiaannet 等[16]的研究仍支持这一观点，但是短期服用阿司匹林则几乎不能受益，因此本实验结果可能与服药时间有关；再次，关于阿司匹林使用剂量的问题，近年来的研究结果也不完全一致，多数研究认为低剂量的阿司匹林可抑制肿瘤的发生发展及复发，也有部分研究[17]认为低剂量阿司匹林不能增加肿瘤的生存率；最后，有研究[9]认为，阿司匹林发挥抗肿瘤作用与肿瘤类型、微环境情况密切相关。

通过本实验可以看出，短时间内阿司匹林对兔颊VX-2鳞状细胞癌炎症微环境中DC表型的改善及功能的发挥无明显作用，这可能与其剂量和作用时间有关。接下来将进一步从多种剂量和多个时间点来探索阿司匹林对兔颊VX-2鳞状细胞癌炎症微环境中DC的影响。

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（本文编辑  吴爱华）

[中图分类号]R 730.5

[文献标志码]A   [doi]   10.7518/hxkq.2016.02.015

[收稿日期]2015-08-25； [修回日期]  2015-11-12

[基金项目]遵义市科技局科研基金[遵市科合社字（2013）32号]

[作者简介]陈志红，住院医师，硕士，E-mail：465936809@qq.com

[通信作者]黄桂林，主任医师，博士，E-mail：chaojiehuanghgl@163. com

Effects of aspirin on dendritic cells in the inflammatory microenvironment of rabbit buccal VX-2 squamous cell car-cinoma

Chen Zhihong1, Huang Guilin2, Zhang Nini2, Yi Jie2, Yao Li2, Zhang Lin2. (1. Dept. of Stomatology, People’s Hospital of Guizhou Province, Guiyang 550002, China; 2. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical College, Zunyi 563000, China)
Supported by: Technology Bureau Scientific Research Foundation of Zunyi (No. 32 in 2013). Correspondence: Huang Guilin, E-mail: chaojiehuanghgl@163.com.

[Abstract]Objective To explore the effects of aspirin and inflammation on the maturation and function of dendritic cells (DC) on the supernatant of VX-2 squamous cell carcinoma. Methods   The rabbit buccal VX-2 squamous cell carcinoma models with inflammation were established by tumor particle implantation, mechanical trauma, and high sugar diet. The rabbits were divided into three groups. For the experimental group (rabbit buccal VX-2 squamous cell carcinoma with local inflammation), aspirin were given by gavage for three consecutive days. For the control group (rabbit buccal VX-2 squamous cell carcinoma with local inflammation), normal saline was given by gavage for three consecutive days. For the blank group (tumor without inflammation), normal saline was given by gavage for three consecutive days. Each tumor specimens were collected in three days and made into tissue homogenate. The supernatant was collected after centrifugation. Normal rabbit peripheral blood mononuclear cells were separated and co-cultured with different states of supernatant. The expression of DC surface markers CD83, CD86, and human leukocyte antigen-DR (HLA-DR) were detected by flow cytometry. The state of function of DC was tested by mixed lymphocyte reaction. Results   The positive rate of CD83, CD86, and HLA-DR of  the experimental and control groups were both lower than that of the blank group (P<0.05). In addition, the ability to stimulate T cell proliferation of the experimental and control groups were weaker than that of the blank group (P<0.05). No significant difference was observed between the experi-mental and control groups (P>0.05). Conclusion   Inflammation may inhibit the function and expression of CD83, CD86, and HLADR of DC. The short-term administration of aspirin is not conducive to the phenoty and function of DC in a rabbit buccal VX-2 squamous cell carcinoma inflammatory environment.

[Key words]aspirin;  inflammation;  VX-2 squamous cell carcinoma;  dendritic cell