罗格列酮对糖基化终产物诱导的大鼠心肌成纤维细胞及胶原蛋白合成的影响

侯登立, 符　婷, 匡　霞, 张秀琴, 王素莉

(中国人民武装警察部队后勤学院附属医院 内分泌科, 天津, 300162)



论著

罗格列酮对糖基化终产物诱导的大鼠心肌成纤维细胞及胶原蛋白合成的影响

侯登立, 符婷, 匡霞, 张秀琴, 王素莉

(中国人民武装警察部队后勤学院附属医院 内分泌科, 天津, 300162)

摘要:目的探讨罗格列酮(RGZ)对糖基化终产物(AGEs)诱导的大鼠心肌成纤维细胞(CFs)及胶原蛋白合成的影响。方法采用胰酶消化法和差速贴壁分离法获取CFs，经AGEs诱导，并给予不同浓度RGZ干预48 h, 收集培养上清液，应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测不同浓度RGZ对AGEs作用下的CFs增殖的影响；应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测干预前后胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ含量。结果与AGEs 0 mg/L组比较，经不同浓度AGEs诱导后，各组CFs OD490 nm值有所升高，且随AGEs浓度的增加而呈递增趋势；与未干预组比较，各干预组OD490 nm值、胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ含量均显著降低，且随RGZ浓度的增加呈递减趋势(P<0.05或P<0.01)。结论RGZ对AGEs诱导的CFs增殖及促进胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成作用具有明显的抑制效应，且抑制程度呈浓度依赖性，可有效改善心肌纤维化状态。

关键词:糖基化终产物; 心肌纤维化; 心肌成纤维细胞; 罗格列酮; 增殖; 胶原蛋白

糖尿病心肌病是糖尿病的主要并发症之一，表现为心肌细胞肥大、心肌间质胶原沉积及心肌纤维化[1-2]。心肌纤维化是指心肌正常组织中心肌成纤维细胞(CFs)胶原纤维大量积聚，或胶原成分改变，导致心肌室壁增厚、僵硬，心肌舒张功能障碍，并最终导致心力衰竭，是糖尿病的主要致死原因[3]。糖基化终产物(AGEs)与糖尿病心肌纤维化密切相关，糖尿病长期高血糖状态促进糖基化进程，AGEs增多，继而对心血管系统造成损害[4]。罗格列酮(RGZ)具有心血管系统效应，可抑制多种器官组织纤维化，但其对于糖尿病心肌纤维化的研究较少[5-6]。本研究主要探讨了RGZ对AGEs诱导的CFs增殖及和胶原蛋白合成的干预作用，现报告如下。

1材料与方法

1.1材料

清洁级SD大鼠乳鼠10只(1～4 d，雌雄不限)。实验材料包括胎牛血清(中国北京索来宝公司)，DMEM培养基(低糖型，Gibco公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，四氮唑蓝(MTT，Gibco公司)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，AGEs(东南大学医学院心血管病研究所)，RGZ(美国Santa公司)，大鼠胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(上海生物科技有限公司)，恒温振荡器(THZ-C，中国江苏太仓试验设备厂)和DV70紫外分光光度计(美国Beckman公司)等。

1.2方法

1.2.1新肌成纤维细胞的制备：于无菌条件下取新生大鼠乳鼠的心室组织，置于D-Hanks液中剪碎，加入0.06%胰蛋白酶于37℃水浴，并置于磁力搅拌器上(速率100 r/min)消化成单细胞悬液，由于CFs具有快速贴壁的特点，经2次差速贴壁后，分离得到CFs。经SABC免疫组化染色结果显示，波形蛋白染色呈阳性，血管平滑肌肌动蛋白染色呈阴性，证实分离得到的细胞为CFs。采用体积分数为10%的胎牛血清培养，至融合状态时进行传代，本实验采用2～4代的CFs。

1.2.2AGEs诱导实验：取对数生长期CFs，加入25 g/L胰酶，以含10%胎牛血清的DMEM培养基调节CFs密度至2.5×107/L，加入96孔板中，200 μL/孔，静置培养至细胞贴壁、伸展。分别采用不同浓度AGEs(0、50、100和200 mg/L)共同孵育48 h，收集各组细胞和上清，重复3次。

1.2.3细胞干预实验：干预组中加入200 mg/L AGEs诱导，同时加入不同浓度RGZ(0.1、1、10 mmol/L)进行干预；未干预组以200 mg/L AGEs诱导，但不加RGZ干预；另设对照组，既不加AGEs诱导，也不加RGZ干预; 48 h后，收集各组细胞和上清，重复3次。

1.2.4MTT法检测细胞数量：各干预组及对照组CFs培养48 h后，每孔均加入10 μL MTT溶液(5 g/L), 37 ℃继续培养4 h，弃上清，加入二甲基亚砜，150 μL/孔，振荡混匀后检测OD490 nm。

1.2.5ELISA法检测CFs培养液中胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的含量：向已包被抗大鼠Ⅰ型胶原的96孔酶标板中分别加入100 μL胶原蛋白Ⅰ标准液或100 μL细胞培养上清，混匀，于37 ℃孵育2 h, 弃去板内液体，洗涤5次。每孔加100 μL一抗工作液，置于37 ℃孵育1 h，弃去板内液体，洗涤5次。每孔加100 μL酶标二抗工作液，置于37 ℃孵育1 h, 弃去板内液体，洗涤5次。每孔加100 μL显色液，37 ℃避光孵育10 min，每孔加100 μL终止液终止显色，采用酶标仪检测OD492 nm。绘制标准曲线，计算各个样本浓度。按照同样的方法检测胶原蛋白Ⅲ的浓度。

1.3统计学方法

2结果

2.1RGZ对AGEs诱导CFs增殖的影响

与AGEs 0 mg/L组比较，经不同浓度AGEs诱导后，各组CFs OD490 nm值有所升高，且随AGEs浓度的增加而呈递增趋势。见表1。与未干预组比较，各干预组OD490 nm值显著降低，且随RGZ浓度的增加呈递减趋势(P<0.05或P<0.01)。见表2。

与AGEs 0 mg/L组比较, **P<0.01;

与AGEs 50 mg/L组比较, ##P<0.01;

与AGEs 100 mg/L组比较, △△P<0.01。

与对照组比较, **P<0.01; 与AGEs 200 mg/L组比较, ##P<0.01;

与AGEs+RGZ 0.1 μmol/L组比较, △P<0.05, △△P<0.01;

与AGEs+RGZ 1 μmol/L组比较, ▲▲P<0.01。

2.2RGZ对AGEs诱导CFs胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成的影响

与对照组比较，未干预组及各干预组CFs培养上清中胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ含量显著升高(P<0.01)；与未干预组比较，各干预组中胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ含量显著降低，且随着RGZ浓度的增大而呈递减趋势(P<0.05或P<0.01)。见表3。

与对照组比较, **P<0.01; 与AGEs 200 mg/L组比较, #P<0.05, ##P<0.01;

与AGEs+RGZ 0.1 μmol/L组比较, △P<0.05, △△P<0.01; 与AGEs+RGZ 1 μmol/L组比较, ▲▲P<0.01。

3讨论

CFs是心肌纤维化的主要效应细胞，占心脏细胞的60%，是心脏的支持细胞，并可合成和分泌多种生物学活性物质[7]。心脏中主要含有Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，两者不断更新，其生成和降解保持动态平衡[8]。CFs过度增殖引起胶原合蛋白合成增多，胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ比例失调及排列紊乱，是心肌纤维化发生、发展的关键环节[9]。

AGEs是一组在蛋白质氨基与糖的醛基间非酶性糖基化反应终产物的总称，是引起血管重建的重要机制，与糖尿病心肌纤维化密切相关。持续高糖可促进心肌间质、微血管壁胶原蛋白发生非酶糖化，形成AGEs，AGEs积聚降低胶原蛋白降解，引起胶原蛋白交联、沉积，微血管基底膜增厚，进而导致心肌纤维化[4]。本研究结果显示, AGEs可诱导CFs增殖并促进CFs胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成，且随AGEs浓度的增加，其诱导增殖的作用逐渐增强，与杨蓉等[10]研究结果一致。

RGZ属于胰岛素增敏剂药物，是人工合成的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的配体，除降糖、降压外，还具有抗炎、抗组织器官纤维化、影响细胞增殖与分化等作用，已广泛应用于治疗糖尿病心肌病[11-12]。RGZ与PPAR-γ结合后通过调节核因子κB(NF-κB)抑制其下游靶基因(如转化生长因子β、结缔组织生长因子等)的表达，从而发挥抗纤维化作用[13]。此外，RGZ通过降低血管紧张肽受体-1的表达，可阻断部分血管紧张素转化酶2(AgnⅡ)的促纤维化作用，从而减轻胶原聚集[14]。本研究结果显示，RGZ对AGEs诱导的CFs增殖及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成具有明显的抑制作用，且抑制作用具有浓度依赖性，与李洁等[15]报道一致。本研究中干预组CFs胶原合成虽较未干预组明显降低，但仍显著高于对照组，提示RGZ只能部分抑制AGE对CFs胶原蛋白合成的诱导作用，而并非完全阻断，这可能与糖尿病心肌纤维化的发病原因复杂和参与因素众多相关，需进一步研究[16]。

综上所述, RGZ对于AGEs诱导大鼠CFs增殖及促进胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成具有显著的抑制作用，从而有效逆转心肌纤维化，保护心脏的收缩和舒张功能，延缓和阻断心脏重构，为防治糖尿病心肌纤维化提供了新的思路及理论依据。

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Effect of rosiglitazone on the myocardial fibroblasts and collagen synthesis in rats induced by advanced glycation end products

HOU Dengli, FU Ting, KUANG Xia, ZHANG Xiuqin, WANG Suli

(DepartmentofEndocrinology,TheAffiliatedHospitalofLogisticalCollegeofChinesePeople′sArmedPoliceForces,Tianjin, 300162)

KEYWORDS:advanced glycation end products; myocardial fibrosis; myocardial fibroblasts; rosiglitazone; proliferation; collagen

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of rosiglitazone (RGZ) on the myocardial fibroblasts (CFs) and collagen synthesis in rats induced by advanced glycation end products (AGEs). MethodsCFs were obtained by using trypsin enzyme-digesting method and differential adhesion. After induction by AGEs, different concentrations of RGZ were used to intervene 48 h, and the supernate was collected and cultured. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay was applied to detect the impact of different concentrations of RGZ on the proliferation of CFs under the action of AGEs, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the contents of collagen Ⅰ and Ⅲ before and after intervention. ResultsCompared with AGEs 0 mg/L group, the value of CFs OD490 nmin each group increased, and increased gradually with the concentration of AGEs elevation after induction by different concentrations of AGEs. Compared with non-intervention group, the value of OD490 nmand contents of collagen Ⅰ and Ⅲ in each intervention group decreased significantly, and tended to reduce with the concentration of RGZ elevation (P<0.05 orP<0.01). ConclusionRGZ exerts significantly-inhibitory effects on the proliferation of CFs induced by AGEs and promotion of collagen Ⅰ and Ⅲ synthesis, and this inhibitory degree is concentration-dependent, which can effectively ameliorate the status of myocardial fibrosis.

收稿日期:2015-12-16

通信作者:王素莉, E-mail: wangslwsl@sina. com

中图分类号:R 542.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)11-001-03

DOI:10.7619/jcmp.201611001