褪黑素受体1B基因单核苷酸多态性与多囊卵巢综合征的关系

杨金芳*，杨海美，程志娟（. 滨州市人民医院妇产科，山东　滨州　56600；. 阳信县人民医院妇产科，山东　滨州　56600）



褪黑素受体1B基因单核苷酸多态性与多囊卵巢综合征的关系

杨金芳1*，杨海美1，程志娟2
（1. 滨州市人民医院妇产科，山东滨州256600；2. 阳信县人民医院妇产科，山东滨州256600）

【摘要】目的 探讨褪黑素受体1B（MTNR1B）基因单核苷酸多态性与多囊卵巢综合征（Polycystie ovary syndrome，PCOS）发病的关系，以及与PCOS临床特征、内分泌水平及血糖水平之间的关系。方法 应用聚合酶链反应-基因直接测序法，对182例PCOS不孕患者及196例因输卵管因素或男方因素不孕的患者，进行MTNR1B基因的rs10830963多态性检测，同时测定基础状态下的相关激素水平及空腹血糖。结果 （1）三种基因型及等位基因频率在两组之间的分布，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（2）在PCOS组中，SNP rsl0830963位点不同基因型妇女的空腹血糖水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），BMI、体重、及激素水平，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 MTNR1B基因多态性与PCOS的发病相关，rs10830963位点可能是其易感位点，且与PCOS患者空腹血糖水平有一定关系。

【关键词】褪黑素受体；单核苷酸多态性；多囊卵巢综合征

PCOS起病多见于青春期，为最常见的内分泌紊乱性疾病。以雄激素过高的临床或生化表现、持续无排卵、卵巢多囊样改变为特征，常伴有胰岛素抵抗和肥胖，已影响到5%-10%［1］的育龄期妇女，在不排卵性不孕症中占50%～70%，约20%的PCOS患者需要辅助生殖技术助孕。目前越来越多的研究证明PCOS是一种具有明显遗传异质性的疾病，与多基因、多因素相关联。目前已有报道显示MTNR1B基因多态性涉及生殖的各个环节［2-4］，并且有研究［5］显示其SNP多态性与PCOS有密切相关性。但其相关研究尚处于个案报道的探索阶段。为此，我们来探讨MTNR1B基因的单核苷酸多态性与PCOS发病的关系，及与PCOS的临床特征、内分泌水平、血糖水平的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料

选择2012年1月～2013年5月在青岛市妇女儿童医院生殖中心就诊的PCOS患者182例为实验组，平均年龄（32.28±3.43）岁。PCOS诊断标准参照2003年鹿特丹标准。选择同期196例非PCOS不孕患者作为对照组，主要因输卵管因素、男方因素在我院进行辅助生育技术治疗。所有研究对象均为中国汉族人，均排除全身性疾病、泌尿生殖系统感染性疾病和家族遗传性疾病。

1.2实验方法

（1）抽血时间为月经周期的第3～5天或月经不规律者在B超检查未见优势卵泡时，闭经者日期不限，禁食12 h，于清晨抽取静脉血5 mL，取2 mL采用化学发光酶免疫技术分别检测血清卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）、促黄体生成素（LH）、血清泌乳素（PRL）和睾酮（T），并计算LH/FSH值，同时PCOS组患者测定空腹血糖。所有研究对象均测量身高（cm）、体重（kg），并计算体重指数（Body mass index，BMI），BMI=体重（kg）/身高（m）2。

（2）取200 μL血样（EDTA抗凝）加入到1.5 mL离心管中，加入20 μL Proteinase K溶液，200 μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃水浴，加入200 μL无水乙醇，12 000 rpm离心30 sec，去除上清，再加500 μL缓冲液GD，12 000 rpm离心30 sec，弃废液，加入600 μL缓冲液PW，12 000 rpm离心30 sec，弃废液，重复1次，12 000 rpm离心2 min，倒掉废液。最后滴加100 μL洗脱缓冲液TB，室温放置2～5 min，12 000 rpm离心2 min，将收集到到的DNA放置-20 ℃冰箱保存备用。

（3）PCR扩增的目的基因，测序引物合成：MTNRlB基因的rsl0830963的测序引物参照文献设计，上游引物5ˊ-TTCTGGGGTACGTTGATGATTG-3ˊ，下游引物：5ˊ-AACAGGGG CCACAGTGCA-3ˊ。20 μL测序PCR反应体系为dH2O 8 μL ，10-30 ng/μL DNA 1 μL，20 μmol/L上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCRMasterMix 10 μL。PCR反应条件：预变性95℃，5 min；变性95℃，30 sec；退火60℃，30 sec；延伸72℃，30 sec；共35个循环；终止72 ℃，7 min。PCR产物可于4℃保存。PCR反应结束后，取2 μL扩增产物加入含有溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶中电泳，经紫外线投射下检测，显示扩增产物片段长度为296 bp（图1），上海桑尼公司纯化、基因测序。

图1　PCR产物0.8%琼脂糖电泳图

1.3统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以“±s”表示，采用t检验，计数资料采用x2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结 果

2.1两组一般临床资料、生化指标间的比较

PCOS组的年龄、身高、不孕年限及RPL与对照组相比无明显差异；PCOS组体重明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），=。BMI、LH、E、LH/FSH和睾酮水平也明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。FSH水平低于对照组。见表1。

表1　PCOS组与对照组临床特征及内分泌激素水平比较

2.2MTNR1B SNP rsl0830963位点在对照组及PCOS组基因型频率和等位基因频率比较

两组受试者各基因型的频率按Hardy-weinberg遗传定律进行群体平衡检验，均符合遗传平衡定律（P＞0.05）。MTNR1B基因 rsl0830963位点有三种基因型，分别为CC、GC、GG（见图2、3、4）。在182例PCOS患者中，GG的基因型频率为23.63%（43/182），GC的基因型频率为48.90%（89/182），均明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2、3。在PCOS中G等位基因的基因频率为48.08%（175/364），高于对照组的39.29%（154/392），差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2　SNP位点rs10830963 在PCOS组和对照组中的基因型频率比较

表3　MTNR1B基因rs10830963位点在两组中等位基因频率比较

图3　GC基因型

图4　CC基因型

2.3PCOS组及对照组各基因型与临床特征及生化指标的关系

在rs10830963位点中，PCOS组GG/GC基因型与CC基因型相比，其中空腹血糖有显著性差异（P＜0.05），体重、BMI及激素水平无明显差异（P＞0.05），见表4。在对照组中，体重、BMI、内分泌激素水平在不同基因型间比较均没有明显差异（P＞0.05）。见表5。

表4　PCOS组中不同基因型间各临床特征及生化指标的比较

表5　对照组中不同基因型间各临床特征及生化指标的比较

3　讨 论

褪黑素（MLT）是一种神经内分泌激素，属于吲哚类，主要由脑部松果腺合成和分泌，呈现昼高夜低的节律水平。它不仅可保持生物内环境协调的同步化，调节生物昼夜节律，对抗氧化、抗肿瘤活性，性成熟及生殖免疫反应等也具有重要作用［6］。MLT分泌的节律性与许多生物学功能密切相关，尤其是新陈代谢。Woo MM［7］认为褪黑激素起着直接调节卵巢功能的作用。褪黑激素能通过与颗粒黄体细胞中的褪黑素受体结合，调节孕激素的分泌，LH受体、促性腺激素释放激素受体的基因表达，发生机制可能是褪黑激素通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导通路介导，激活核内的转录因子Elk-1，使其磷酸化，从而参与细胞增殖与分化的调控。

人体内MLT的效应是由MTNR1A和MTNR1B两种不同受体介导［8］，均为7跨膜G蛋白偶联受体超家族成员，存在PKC、PKA磷酸化位点等，可通过激活cAMP信号或磷脂酰肌醇信号通路等介导细胞不同功能。褪黑素膜受体广泛存在于下丘脑、垂体、生殖系统的卵巢、子宫、输卵管及睾丸中，其中卵巢受体特异性结合量最高。进入核内的褪黑素与受体形成复合物，调控靶细胞的基因转录，影响基因的表达。

MTNR1B作为褪黑激素信号传导通路的关键环节，基因的多态性可能会引起受体表达与功能的改变，从而影响褪黑素信号传导，导致多种疾病的发生。2009年Prokopenko等［9］进行了多项全基因组关联研究，发现MTNR1B的rs10830963变异与空腹血糖水平关联最强，此位点处G突变因子可以使空腹血糖增加，且与β细胞的功能损害有密切联系。国内外均有研究显示：MTNR1B rs10830963和其他基因位点具有协同效应，可以升高血糖异常，损害β细胞功能，降低胰岛素分泌，进而增加患2型糖尿病的风险［10-11］。在本研究中，在SNP rsl0830963位点，不同基因型PCOS妇女的空腹血糖水平比较有差异，差异有统计学意义（P＜0.05），BMI、体重、及激素水平无明显差异（P＞0.05）。说明SNP rsl0830963位点与PCOS的血糖水平有一定关系，可能是G突变因子使空腹血糖增加，与目前的研究结果相一致。

褪黑激素在生殖过程中起着重要作用。活性氧在生理水平时可以促进细胞增殖、分化，在高水平时不仅可以使细胞凋亡或受损，导致细胞代谢、功能和结构改变，甚至导致DNA损伤。卵泡液中的活性氧失衡可以导致卵母细胞受损、卵泡闭锁、卵泡成熟障碍等。褪黑激素及其代谢产物是一种强大的抗氧化剂和直接自由基清除剂，可以很好的保持动态平衡，减少线粒体氧化应激反应，可以保护生殖细胞免受损伤，促进卵泡发育、成熟。而且研究［12］发现卵巢具有褪黑素旁分泌功能，卵泡液中褪黑素水平比血清中高3倍，且与昼夜及季节性节律无关，对卵泡发育及成熟极其重要。崔媛媛的研究中示PCOS组血清褪黑素水平比正常组升高，而卵泡膜中褪黑素水平却较低，说明褪黑素与PCOS病理生理学改变有着密不可分的联系。褪黑素不仅与人类的生殖过程息息相关，在动物中也如此。有研究示，对大鼠进行持续光照或摘除松果体，可出现类似于PCOS的症状及病理改变，如动情周期延长，卵巢表面上皮及间质增生、呈多囊样改变，持续无排卵等［13］。PCOS为排卵障碍性疾病，可推测褪黑素受体基因多态性与PCOS发病有关。除此之外，PCOS的患者多伴有肥胖、胰岛素抵抗，与2型糖尿病的临床特征及病理生理学机制及其相似，而MTNR1B的基因多态性已被发现可以增加糖尿病发生的危险性，由此推断MTNR1B的多态性也是PCOS的一个发病原因。本研究的结果验证了MTNR1B基因多态性与PCOS的发生确实有密切联系，rs10830963基因多态性可能影响到了褪黑素受体表达或功能变化，使褪黑激素发生了异常，从而导致PCOS的发生。在实验中，PCOS组中GG和GC基因型频率（23.63%、48.90%）均高于正常组，而且PCOS组等位基因G的频率也明显高于对照组，差异具有显著性。在两组中，无论是基因型还是等位基因频率，均具有显著性差异，表明MTNRlB基因是中国汉族妇女PCOS的易感基因。李超［5］等人的研究示SNP rsl0830963位点是中国汉族人群PCOS的易感位点，与PCOS的发生发展以及病理生理改变有相关性，而且该多态位点与PCOS的胰岛素抵抗、血糖升高密切相关。本研究的结果与李超等人的结果相一致，都表明MTNRlB基因的单核苷多态性与PCOS的发病有一定的关系，至于具体的发病机制目前只是一个初步的探讨，还需进一步的研究来阐述。

参考文献

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本文编辑：苏日力嘎

【中图分类号】R71

【文献标识码】A

【文章编号】ISSN.2095-8803.2016.05.145.04

作者简介：杨金芳（1978-），女，山东滨州人，硕士，主治医师，研究方向：生殖内分泌

通讯作者：杨金芳，Tel：18293190817，E-mail：sd3498@163.com

Association of rs10830963 SNPs in the melation receptor （MTNR IB）gene with polycystic ovary syndrome

YANG Jin-fang1*, YANG Hai-mei1, CHENG Zhi-juan2
（1.Department of Obstetrics and Gynecology, Binzhou People's Hospital, Shandong Binzhou 256600,China；2.Department of Obstetrics and Gynecology, Yangxin County People s Hospital,Shandong Binzhou 256600,China）

【Abstract】Objective The current study was aimed to evaluate the association between MTNR1B gene polymorphisms and polycystic ovary syndrome. In addition, the relationship of clinical features, endocrine level and glucose levels with PCOS patients would be discussed. Methods The single-nucleotide polymorphisms （SNPS）, rsl0830963, in the MTNRlB gene were detected in 182 PCOS patients and 196 patients under-going IVF who were due to male factor or tubal factor. The single nucleotide polymorphisms （SNPs） were detected through polymerase chain reaction and a direct sequencing protocol. Serum hormone levels and plasma glucose level were detected. Results （1） The difference of CC, GC and GG three-genotype distribution between the two groups had statistical signifi cance （P＜0.05）. G allele frequency in PCOS group （48.08%） was signifi cantly higher than that in the controls （39.28%）, and it had statistical signifi cance （P＜0.05）. （2） The SNP, rs10830963 was signifi cantly associated with higher plasma glucose concentrations （P＜0.05）.There was no significant difference in the clinical and hormone levels in PCOS women with different genotypes in the SNP.Conclusion MTNR1B gene polymorphism is associated with the pathogenesis of PCOS. The SNP, rsl0830963, in the MTNRlB gene is not only associated with susceptibility to PCOS, but also with the level of fasting plasma glucose of PCOS patients.

【Key words】Melation receptor; Nucleotide polymorphisms; Polycystic ovary syndrome