组织型基质金属蛋白酶抑制剂-1、基质金属蛋白酶-9在老年女性压力性尿失禁患者阴道壁中的表达及意义

吕　顺　陈　隽　冯化杰

(齐齐哈尔医学院基础医学院，黑龙江　齐齐哈尔　161006)

组织型基质金属蛋白酶抑制剂-1、基质金属蛋白酶-9在老年女性压力性尿失禁患者阴道壁中的表达及意义

吕顺1陈隽2冯化杰

(齐齐哈尔医学院基础医学院，黑龙江齐齐哈尔161006)

〔摘要〕目的观察组织型基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1和基质金属蛋白酶(MMP)-9在女性压力性尿失禁(SUI)患者阴道壁中的表达情况及其机制。方法随机选取25例SUI患者作为观察组，25例盆底器官脱垂症(POP)患者作为脱垂组，25例妇科良性疾病患者作为对照组。取所有受试者阴道壁结缔组织制成切片，采用免疫组织化学法对切片进行染色，采用RT-PCR法检测所有组织中TIMP-1和MMP-9 mRNA的表达情况。结果观察组和脱垂组TIMP-1、MMP-9蛋白的表达及TIMP-1、MMP-9 mRNA ΔCt值差异显著(P>0.05)，对照组TIMP-1蛋白表达显著高于观察组和脱垂组，而MMP-9蛋白表达显著低于观察组和脱垂组(P<0.05)。结论在SUI和POP患者的阴道壁组织中，MMP-9呈现高表达，TIMP-1呈现低表达，二者可能参与了SUI和POP的发病过程。

〔关键词〕压力性尿失禁；组织型基质金属蛋白酶抑制剂-1；基质金属蛋白酶-9

盆底功能障碍性疾病(PFD)简称盆底疾病，主要包括压力性尿失禁(SUI)和盆腔器官脱垂(POP)。目前对于PFD的发病机制尚未探明。有研究发现，SUI的患者常常伴发POP，故推测二者在发病机制上可能存在相似性〔1〕。目前研究认为，盆底韧带和筋膜组织的降解可能是导致PFD的原因之一〔2〕。基质金属蛋白酶家族(MMPs)是一类蛋白酶，对细胞外基质具有降解功能。而组织型基质蛋白酶抑制剂(TIMPs)被发现具有抑制MMPs活性的作用。本研究探讨TIMP-1和MMP-9在老年女性SUI患者阴道壁中的表达情况。

1材料与方法

1.1一般资料随机选取2014年6～12月我院妇科收治确诊为SUI并拟行TVT或TVT-O手术的患者25例作为观察组，年龄51～63岁，平均(56.9±6.6)岁，平均产次(2.04±0.56)次；另选25例确诊为POP患者为脱垂组，年龄51～61岁，平均(54.2±5.3)岁，平均产次(1.92±0.63)次；25例拟行手术治疗的妇科良性疾病作为对照组，其中子宫肌瘤者18例，宫颈上皮内瘤变7例，年龄51～61岁，平均(55.3±7.4)岁，平均产次(2.11±0.41)次。三组平均年龄和平均产次等一般临床资料无显著差异(P>0.05)。

1.2入选标准〔3〕①所有患者近6个月内未使用过雌激素药物；②无盆底组织手术史；③全身各处无基地组织病；④无生殖道感染性疾病；⑤脱垂组患者未合并SUI。观察组患者入选标准：① 尿常规正常，尿培养阴性；② 神经系统功能正常；③ 膀胱内压、容量、感觉均正常；④参与尿量正常；⑤ 不存在非自主逼尿肌收缩。排除卵巢功能性肿瘤者、肺纤维化者、肝硬化者、类风湿关节炎者。

1.3实验方法本研究获得医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书，均于手术中在阴道正上方取大小为0.1 cm×0.3 cm×0.3 cm阴道壁组织各两块，用0.9%NaCl将血液冲净，一块置于10%甲醛(中性)中保存，一块置于Ep管中，并置于液氮中保存。

1.3.1免疫组织化学(S-P)法染色将甲醛中的组织块取出，常规石蜡包埋，每例标本切成厚3 μm的切片3片，采用S-P法对切片进行TIMP-1和MMP-9的检测。选用兔抗人TIMP-1单克隆抗体和鼠抗人MMP-9单克隆抗体(均购自上海研晶生物科技有限公司)，阴性标本采用磷酸盐缓冲液(PBS)作为一抗。SP试剂盒与DAB显色剂均购自北京北瑞达医药科技有限公司。所有操作均严格按照试剂或试剂盒相应说明书操作。10×40倍镜下，选取4个互不重叠的视野观察。用Image pro plus 4.0计算染色颗粒的累积光密度值(IOD)，其IOD与染色程度呈正比。

1.3.2RT-PCR法检测RNA将液氮中的组织块取出，在4℃环境中将组织切成小块，研磨、离心后用Trizol裂解液将组织中总RNA提取。用MMLV逆转录酶与随机引物进行RT-PCR(5333，Eppendorf)，合成cDNA，反应体系：Buffer 5 μl、dNTP 1.25 μl、RNA酶抑制剂0.65 μl、MMLV逆转录酶1 μl、oligo-dT 1 μl，mRNA 1 μl、DEPC蒸馏水10.1 μl。逆转录条件：42℃下60 min，95℃下5 min。然后利用荧光定量PCR，检测TIMP-1 mRNA和MMP-9 mRNA相对含量，TIMP-1 mRNA序列：5′-TTCCACAGGTCCCACAACCGCAGC,3′-CGTCCACAAGCAATGAGT,片段长度228 dp；MMP-9序列：5′TGTGGCAGCACCAGGGCAGC GTGGGAGCCAGGGCC，3′-GCCTGCCACTTCCCCTTCATC,长度473 dp，反应体系：SYDR Green 8 μl、plus 2 μl、上游引物、下游引物各1.2 μl、去RNA酶6.6 μl、cDNA 1 μl，扩增条件：94℃下30 s，45℃下30 s，72℃下60 s，进行40个循环，后72℃下300 s。将PCR产物进行3%琼脂凝胶电泳，EB染色后置于紫外灯下观察。根据RT-PCR曲线计算其△Ct值。

1.4统计学方法采用SPSS18.0软件进行χ2检验、t检验、单因素方差分析和Spearmon相关性检验。

2结果

2.1TIMP-1、MMP-9在组织中的染色情况TIMP-1和MMP-9均主要在结缔组织细胞的细胞质内表达，均为淡黄色至棕黄色颗粒，见图1，图2。

图1　TIMP的表达情况(10×40)

图2　MMP-9的表达情况(10×40)

2.2各组TIMP-1和MMP-9的表达情况三组TIMP-1、MMP-9蛋白表达差异显著(P<0.05)，观察组和脱垂组无显著差异(P>0.05)，对照组TIMP-1蛋白表达显著高于观察组和脱垂组，而MMP-9蛋白表达显著低于观察组和脱垂组(P<0.05)，见表1。

2.3PCR产物观察电泳结果各目的基因在各组中的表达，见图3。

2.4三组患者TIMP-1和MMP-9 mRNA△Ct值结果三组TIMP-1、MMP-9 mRNA△Ct值差异显著(P<0.05)，观察组和脱垂组间无显著差异(P>0.05)，对照组TIMP-1 mRNAΔCt值显著高于观察组和脱垂组，而MMP-9 mRNAΔCt值显著低于观察组和脱垂组(P<0.05)，见表2。

表1　各组TIMP-1和MMP-9的

与对照组比较：1)P<0.05；下表同

1、3、5条带分别为观察组、脱垂组和对照组的TIMP-1；2、4、6条带分别为观察组、脱垂组和对照组的MMP-9图3　TIMP-1和MMP-9 mRNA电泳结果

组别TIMP-1MMP-9观察组1.996±0.2641)16.241±0.7111)脱垂组1.908±0.4131)15.982±0.6491)对照组3.682±0.44910.124±0.816

2.5TIMP-1和MMP-9在SUI中表达相关性TIMP-1与MMP-9的表达呈负相关(r=-0.916，P<0.001)。

3讨论

SUI是由多种致病因素相互作用导致的，年龄、妊娠与分娩情况、体内雌激素水平都是造成SUI的原因，但对于SUI的发病机制尚不明了，目前大部分学者赞同盆底支持结构的薄弱化与SUI密切相关〔4，5〕。而盆底的支持主要来自肌肉、韧带和筋膜，而连接胶原、弹性硬蛋白、网硬蛋白的细胞外基质(ECM)是在这些组织中起到十分重要的作用。

近年来，MMPs和TIMPs在SUI发病中的作用逐渐受到重视，并被认为是导致SUI的重要机制之一。MMP-9是一种明胶酶，可以将明胶水解，当盆底筋膜组织中MMP-9存在过表达时，对筋膜中Ⅰ型和Ⅲ型胶原大量降解，从而减弱了筋膜的支持作用〔6〕。本研究结果与刘颖琳等〔5〕的研究结果一致，提示MMP-9在SUI和POP患者的阴道壁组织中表达增强，MMP-9可能参与了SUI和POP的发病。结合本次研究结果可以推测，SUI和POP的共同发病机制使MMP-9的过量表达，而导致阴道壁的Ⅰ型和Ⅲ型胶原大量降解，减弱了其支持功能造成的。本研究还提示由于阴道壁组织细胞内MMP-9基因的活化造成了MMP-9的过表达。

目前已探明的人体内对于MMPs具有抑制作用的主要有两大类：一类为血源性，即纤溶酶原激活剂抑制物；另一类为组织源性，即TIMPs。TIMPs是人体内对MMPs起到监管作用，目前已知的TIMPs有TIMP1～4。马双玲等〔6〕发现TIMP-1和TIMP-2具有较强的对MMPs的抑制作用，几乎可以抑制目前所有已发现的MMPs活性。本研究结果与Choi等〔7〕的研究结果一致，这提示TIMP-1在SUI和POP患者的阴道壁组织中表达降低，而结合前面的结果，可以推测，是由于TIMP-1的表达降低，导致TIMP-1和MMP-9之间的平衡被打破，导致胶原降解增强。曾有学者认为SUI是由于盆底结缔组织中成纤维细胞合成和分泌胶原蛋白的能力下降所致，但本次研究结果说明SUI和POP是由于胶原降解过多所致〔8〕。本次研究还提示SUI和POP患者阴道壁组织中TIMP-1的基因被抑制，从而造成TIMP-1的表达减少，但具体机制仍需要进一步研究。

综上，在老年SUI和POP患者的阴道壁组织中，MMP-9呈现高表达，TIMP-1呈现低表达，二者可能参与了SUI和POP的发病过程。

4参考文献

1Li GY，Cui WS，Zhou F,etal.Pathology of urethral fibromuscular system related to parturition-induced stress urinary incontinence and TGF-β1/Smad pathway〔J〕.Mol Cell Biochem，2012;364(1/2)：329-35.

2Kim IG，Piao S，Hong S,etal.The effect of a bioactive tissue-engineered sling in a rat of stress incontinence model〔J〕.J Biomed Mater Res A，2012;100A(2)：286-92.

3Mostafa A，Lim CP，Hopper L,etal.Single-incision mini-slings versus standard midurethral slings in surgical management of female stress urinary incontinence：An updated systematic review and meta-analysis of effectiveness and complications〔J〕.Eur Urol，2014;65(2)：402-27.

4Kim JH，Shin SH，Oh MM,etal.Factors affecting transient urinary retention after transobturator tape mid-urethral sling surgery for female patients with stress urinary incontinence：A single center experience〔J〕.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2013;168(1)：107-11.

5刘颖琳，谭玉清，丁红，等.水中待产产妇盆底组织MMP-1、TIMP-1的表达及临床意义〔J〕.中山大学学报(医学科学版)，2013;34(4)：568-73.

6马双玲，王鲁文，马学玲，等.TGF-β1/CTGF信号传导通路在女性压力性尿失禁发生中的研究〔J〕.中国妇幼保健，2014;29(11)：1763-6.

7Choi SJ，Oh SH，Kim IG,etal.Functional recovery of urethra by plasmid DNA-loaded injectable agent for the treatment of urinary incontinence〔J〕.Biomaterials，2013;34(20)：4766-76.

8Jiang YH，Wang CC，Chuang FC,etal.Positioning of a suburethral sling at the bladder neck is associated with a higher recurrence rate of stress urinary incontinence〔J〕.J Ultrasound Med，2013;32(2)：239-45.

〔2015-10-20修回〕

(编辑李相军/滕欣航)

基金项目：黑龙江省卫生厅科研基金资助(No.2014-278)

通讯作者：陈隽(1975-)，女，副主任医师，主要从事妇产科疾病研究。

〔中图分类号〕R694+.54

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2723-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.072

1齐齐哈尔医学院附属第三医院

2齐齐哈尔医学院病理学院微形态实验中心

第一作者：吕顺(1993-)，男，主要从事麻醉及泌尿外控研究。