靶向c⁃myc基因的siRNA基因干扰对大肠癌Lovo细胞增殖与凋亡的影响

刘集鸿　蒋楠楠　张丽科　邓宁



靶向c⁃myc基因的siRNA基因干扰对大肠癌Lovo细胞增殖与凋亡的影响

刘集鸿1蒋楠楠1张丽科1邓宁2

［摘要］目的阐述靶向c⁃myc基因的siRNA基因转染干扰对大肠癌Lovo细胞增殖与凋亡的影响作用。方法将靶向c⁃myc基因的siRNA片段转染入大肠癌Lovo细胞，特异沉默c⁃myc基因，通过实时荧光定量PCR法检测c⁃myc mRNA表达水平，原位末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）检测肿瘤细胞凋亡情况及噻唑蓝法［3⁃（4，5⁃dimethyl⁃2⁃thiazolyl）⁃2，5⁃diphenyl⁃2⁃H⁃tetrazolium bromide，MTT］检测细胞的增殖能力。结果经过转染的Lovo细胞组与未转染的对照组c⁃myc mRNA表达量比率为0.22∶1，c⁃myc mRNA表达量比例有统计学差异（P〈0.05）。经过转染的Lovo细胞与未转染的对照组的凋亡指数分别为32.4%与65.4%，具有显著性统计学差异（P〈0.01）。MTT检测经过转染的Lovo细胞与未转染的对照组的细胞增值率，分别为79.28%与38.32%，具有极其显著性统计学差异（P〈0.001）。结论将靶向c⁃myc基因的siRNA片段转染入大肠癌Lovo细胞，特异沉默c⁃myc基因，从而证实c⁃myc抑制大肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡的作用，从而为大肠癌的基因治疗寻求更多的治疗靶点。

［关键词］Survivin；hTERT；c⁃myc；大肠癌；Lovo细胞；转染；凋亡

作者单位：1.惠州市第一人民医院检验科，广东，惠州516001
2.暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室，广东，广州510632

大肠癌是严重威胁人类生命健康的常见肿瘤之一，我国大肠癌的发病率呈逐年上升的趋势，尽管采用手术、放疗、化疗等综合治疗的方法，但是疗效并不乐观，而基因免疫治疗有其独特的优势。相关研究推测，c⁃myc、Survivin及hTERT等基因在大肠癌的发生发展中起协同作用［1］。c⁃myc癌基因属核蛋白基因，具有转化细胞的能力，并具有与染色体DNA结合的特性，在调节细胞生长、分化及恶性转化中发挥作用。现有研究证实，c⁃myc在大肠癌发生发展中发挥重要的调控作用［2］。研究提示Survivin可能参与c⁃myc激活，从而上调hTERT，而相关研究推测c⁃myc可能是Sur⁃vivin的上游调控基因，Survivin、hTERT、c⁃myc致大肠癌细胞凋亡的分子机制目前尚未完全阐明［3］。

现有研究证实，Survivin，hTERT，c⁃myc在大肠癌组织中均有阳性表达，并且三者的阳性表达呈正相关，提示原癌基因c⁃myc激活、Survivin表达上调及端粒酶活性的增强，可能在大肠癌发生机制中起协同作用［4-5］。本课题将靶向c⁃myc基因的siRNA片段转染入大肠癌Lovo细胞，特异沉默c⁃myc基因，验证c⁃myc抑制大肠癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用，并探讨促使细胞凋亡的分子机制，从而为大肠癌的基因治疗寻求更多的治疗靶点。现报告如下：

1　材料和方法

1.1研究对象

体外培养大肠癌Lovo细胞，细胞株由暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室提供。

1.2主要仪器与试剂

1.2.1主要试剂与耗材

RP⁃1640培养液（GBICO，美国）；新生牛血清（GBICO，美国）；转染试剂Lipofectamine2000 （Invitrogen，美国）；miScriptReverseTranscriptionkit （QIAGEN，德国）；TRIzol（Invitrogen，美国）；胰酶（GBICO，美国）；蛋白裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；Zx蛋白上样缓冲液（上海碧云天生物技术有限公司）；c⁃myc引物序列为：上游引物5′⁃TAT AGA CTC GAG CGG AGT CAT GGG⁃3′，下游引物5′⁃AAG TCA GGA AGG CAG TGA TCG CAA⁃3′生工生物工程（上海）股份有限公司，上海］；TaqMan探针：FAM⁃TTT TCG TCC GAC TCC CCG TAG GCC GTA TAC GGC⁃TEMRA（FAM、TEMRA为荧光素）；PCR试剂盒（ABI，美国）RNA上样缓冲液（上海杰美基因医药科技有限公司）；RNA电泳液（Amresco，美国）；二甲基亚矾（Sigma，美国）；6孔、96孔细胞培养板（GBICO，美国）；l.5 mL、0.5 mL EP管；1 mL、0.2 mL、10 μ L移液枪头（Eppendorf，德国）；0.2 μm，20×20 cm PVDF膜（Bio⁃Rad，美国）。

1.2.2主要仪器

VD650超净工作台（苏州净化工作台设备有限公司），l mL、0.2 mL、10 μ L移液枪（Eppendorf，德国），CFX96 TouchReal⁃time PCR仪（Bio⁃Rad，美国），MCO⁃20AICCO2细胞培养箱（Sanyo，日本），5804R低温高速离心机（Eppendorf，德国），ECP3000电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司），Multiskan FC酶标仪（Thermo，美国），IX71倒置显微镜（OLYMPUS，日本）。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养

Lovo细胞株用含10%新生牛血清RPMI1640培养液置于37℃细胞培养箱内培养。倒置显微镜下观察细胞生长情况，传代培养。

1.3.2构建siRNA片段并转染入Lovo细胞

首先在GeneBank中查的c⁃myc基因的全序列，用siRNA设计软件初筛6对GC比在40%～50%之间的siRNA，把所得序列挑选1条交生工生物工程（上海）股份有限公司，体外合成靶向c⁃myc基因的siRNA和1条阴性对照siRNA。序列如下：c⁃my c⁃siRNA正义链：5′⁃AACAGGCUUGGUCCACUGC⁃3′对照⁃siRNA正义链：5′⁃GGUAGCAUUGCU⁃AUGGGCG⁃3′采用Invintrogen公司介导的脂质体转染技术转染。转染前24 h把Lovo细胞消化并接种适量于6孔板上1640培养基培养，24 h后把siRNA和Lipofectamine2000以合适计量加入每孔细胞，混匀，37℃培养24 h后，弃去培养液，换用含10%新生牛血清的1640培养基继续培养48 h后，观察效果。本实验在暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室进行。

1.3.3实时荧光定量PCR法（realtime⁃fluores⁃cence quantitative polymerase chain reaction，RT⁃PCR）检测c⁃myc mRNA表达水平

依据PCR试剂盒说明书，按照说明书步骤操作进行，按照文献［6］RT⁃PCR方法检测。用Trizol试剂提取培养的转染的细胞，提取未转染的细胞作为对照组，提取总RNA，加入Trizol 1 mL，氯仿0.2 mL，离心取上清加入0.4 mL异丙醇，离心弃上清，70%乙醇沉淀，凝胶电泳仪测RNA浓度，分光光度计检测纯度［6］。未转染的细胞与转染的细胞分别设5个重复组，通过用PCR仪，制备cDNA，具体反应体系和时间为：10 μ L RNA，20 μ L反应液，37℃1 h，95℃3 min。RT⁃PCR实验反应体系：5×缓冲液10 μL，上下游引物各1 μL，探针1 μL，核苷1 μL，Taq酶1 μL，cDNA 5 μL，三蒸水30 μL，总体积50 μL。反应时间为：93℃预变性5 min；93℃45 s，55℃1 min，40个循环；72℃5 min；4℃终止。

样本中c⁃myc mRNA模板拷贝数。设定大于40个循环仍无荧光信号明显增加的样本，c⁃myc mRNA表达为阴性，数值以“0”计入统计资料。分析熔解曲线，确定阴阳性结果。

1.3.4细胞检测方法

采用原位末端标记法（terminal deoxynucleo⁃tidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）检测肿瘤细胞凋亡情况以及噻唑蓝法［3⁃（4，5⁃di⁃methyl⁃2⁃thiazolyl）⁃2，5⁃diphenyl⁃2⁃H⁃tetrazolium bromide，MTT］检测细胞的增殖能力。

转染培养的Lovo细胞消化后，TUNEL法检测肿瘤细胞，按照厂家提供的TUNEL试剂盒说明完成操作，以未转染细胞作为阴性对照，阴性对照以稀释液代替酶溶液。凋亡细胞形态可见细胞完整，体积缩小，固缩成团，随机选个视野，高倍镜下计数凋亡细胞占肿瘤细胞的比例，即为凋亡指数（apoptosis index，AI）。

转染培养的Lovo细胞消化后，加入20 μ L MTT，孵育30 min后加入二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）终止反应，酶标仪测定结果，以未转染细胞作为阴性对照。本实验在暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室进行。

1.4统计学处理

运用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计描述和分析，符合正态分布的数据以均数±标准差（±s）表示，两组间的比较采用student⁃t检验。若方差不齐，则组间比较采用秩和检验。P〈0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1转染培养的Lovo细胞

如图1所示，转染培养的Lovo细胞在显微镜下显示（×500），细胞生长状况良好。

2.2c⁃myc mRNA表达水平

RT⁃PCR结果如下图2所示。作为对照的未转染的Lovo细胞，c⁃myc熔解曲线呈现S型扩增曲线，结果显示为阳性，转染的Lovo细胞c⁃myc结果为阴性。由各自的Ct值算出对照组2⁃ΔΔCt为1，转染组为0.22（表1），显示转染组的c⁃mycmRNA的表达量是对照组的0.22倍，说明转染组的c⁃myc表达量比未转染的表达量显著降低，结果指示靶向c⁃myc mRNA的siRNA片段基因干扰成功。

2.3转染与未转染Lovo细胞c⁃myc mRNA表达情况

经过转染的Lovo细胞与未转染的对照组c⁃myc mRNA的2⁃ΔΔCt比值为0.22∶1，P=0.012，有统计学差异（P〈0.05），指示靶向c⁃myc mRNA的 siRNA片段构建并转染成功。经过转染的Lovo细胞与未转染的对照组的凋亡指数分别为32.4%与65.4%，转染的细胞与未转染的细胞凋亡指数相比，P=0.0 012，具有显著性统计学差异（P〈0.01），指示靶向c⁃myc mRNA的siRNA片段基因干扰成功，c⁃myc基因具有诱导细胞凋亡的作用。MTT检测经过转染的Lovo细胞与未转染的对照组的细胞增值率，分别为79.28%与38.32%，转染的细胞与未转染的细胞增值率相比，P=0.0 009，具有极其显著性统计学差异（P〈0.001），指示靶向c⁃myc mRNA的siRNA片段基因干扰成功，c⁃myc基因具有抑制细胞增殖的作用。转染与未转染Lovo细胞c⁃myc mRNA的拷贝数、凋亡指数、增值率都具有统计学意义（表1）。

表1　转染与未转染Lovo细胞c⁃myc mRNA表达情况Table 1 The expression statuses of c⁃myc mRNA in the transfection and non⁃transfection Lovo cells

3　讨论

大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，严重威胁人类的生命健康。随着我国国民生活水平的改善，饮食结构的改变，大肠癌的发病率呈逐年升高趋势，我国大肠癌发病率位于恶性肿瘤的第3位，而病死率位于第5位［7］。近年来随着吻合器的广泛应用及各种新式化疗药物的出现，国际上很多学者建议采用在手术治疗的基础上辅助以化疗、放疗、同步放化疗、生物治疗和中医药治疗等在内的一系列综合治疗手段，明显地提高了大肠癌治疗效果［8］。

c⁃myc基因目前是公认的癌基因，在多种恶性肿瘤中c⁃myc都呈高表达。有研究表明，c⁃myc和EGFR基因在鼻咽癌中不仅存在过度表达，而且有拷贝数增加，并认为8q24的c⁃myc基因是鼻咽癌中最初被激活的靶基因［9-10］。因此，特异性下调c⁃myc基因的过度表达在对抗鼻咽癌的过程中可能是一个潜在的治疗性策略。Li等［11］研究发现大肠癌中c⁃myc表达明显高于大肠腺瘤和正常组织。陶凯雄等［12］用葡聚糖磁性纳米微粒作为基因载体，进行磁控靶向RNA干扰抑制大肠癌细胞癌基因c⁃myc表达的研究，牛朝霞等［13］用构建好的小干扰RNA载体，转染细胞后研究抑制内源性原癌基因c⁃myc表达对鼻咽癌细胞5⁃8F的影响。本实验使用的是siRNA直接转染沉默c⁃myc基因，与之前的构载体的基因治疗方法相比，有着强大的优势，微量的siRNA即可使其编码致病基因产物的含量下降90%以上［14］。尽管注入细胞的siRNA的浓度远低于体内同源mRNA的水平，却足以产生强大的干扰效应［15］。siRNA干扰方法减少了传统基因治疗方法大剂量用药带来的毒副作用及免疫效应，为癌症的治疗带来了新的希望［16］。本研究结果显示，转染与未转染Lovo细胞c⁃myc mRNA 的2⁃ΔΔCt表达比值、凋亡指数、增值率都具有统计学意义。经过转染的Lovo细胞与未转染的对照组c⁃mycmRNA表达量相比显著降低，说明靶向c⁃myc mRNA的siRNA片段构建并转染成功。经过转染的Lovo细胞与未转染的对照组的凋亡指数相比显著降低，说明靶向c⁃myc mRNA的siRNA片段基因干扰成功，并且验证了c⁃myc基因的诱导细胞凋亡的作用。MTT检测经过转染的Lovo细胞与未转染的对照组的细胞增值率相比显著升高，说明靶向c⁃myc mRNA的siRNA片段基因干扰成功，并且验证了c⁃myc基因的抑制细胞增殖的作用。本研究特异沉默c⁃myc基因，从而证实c⁃myc具有抑制大肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡的作用。通过基因沉默与干扰的方式，可以抑制大肠癌细胞的生长，从而为大肠癌的基因治疗寻求更多的治疗靶点。

21世纪以来，临床多学科工作团队（multidis⁃ciplinary team，MDT）逐渐成为国际上肿瘤治疗的主流模式。MDT是建立在循证医学基础上的由多个相关学科、相对固定的专家组成工作组，针对某一器官或系统疾病，通过定期、定时、定址的会议形式，提出适合患者病情的最优治疗方案，继而由相关学科单独执行或多学科联合执行治疗方案，其不但能够提供给患者个体化的治疗，而且能够更加高效地治疗肿瘤患者［17］。日本国立癌症中心，“Tumor Board”与MDT相似，由各相关学科医生组成团队，经团队讨论后并由其提供治疗方案，将基础研究与肿瘤多学科治疗联系起来，并提升临床研究质量，使大肠癌治疗效果能够更上一层楼［18］。临床与科研与多学科的联合治疗，是未来治疗肿瘤的主流模式，也是我们致力的方向。

目前相继报道有小分子Aurora⁃A抑制剂，实验发现它们具有抗肿瘤活性，Aurora⁃A有可能成为肿瘤治疗的一个新靶点［19］。本研究特将靶向c⁃myc基因的siRNA片段转染入大肠癌Lovo细胞，特异沉默c⁃myc基因，从而证实c⁃myc抑制大肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡的作用，从而为大肠癌的基因治疗寻求更多的治疗靶点。c⁃myc、Survivin及hTERT等基因在大肠癌的发生发展中起协同作用作用机制本实验室仍然在研究，在未来的研究中，我们会注重协同作用机制方面的内容的研究，争取在大肠癌的基因治疗征程上寻求更多的治疗靶点。

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论著

论著

The effect of the interference on the siRNA with targeted c⁃myc gene on the proliferation and apoptosis of colorectal cancer Lovo cell

LIU Jihong1，JIANG Nannan1，ZHANG Like1，DENG Ning2
（1. Clinical Laboratory，the First People's Hospital of Huizhou City，Huizhou，Guangdong，China，516001；
2.Guangdong Key Laboratories on Molecular Immune Antibody Engineering，Jinan University，Guangzhou，Guangdong，China，510632）

［ABSTRACT］Objective To study the effects that interference of the siRNA with targeted c⁃myc gene has on the proliferation and apoptosis of colorectal cancer Lovo cell. Methods The siRNA clips with targeted c⁃myc gene was transfected into the colorectal cancer Lovo cells, then the specific c⁃myc gene was specifically silenced. The c⁃myc mRNA expression level was detected using realtime⁃fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT⁃PCR), and the apoptosis of the tumor cell was detected through the terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) method, while the proliferation of the tumor cell was detected through the 3⁃(4, 5⁃dimethyl⁃2⁃thiazolyl)⁃2, 5⁃diphenyl⁃2⁃H⁃tetrazolium bromide (MTT) method. Results The rate of the expression of the c⁃myc mRNA of the transfected Lovo cell group and non⁃transfected group was 0.22:1, which was statistically significant (P〈0.05). The indices of apoptosis of the transfected Lovo cell group and non⁃transfected group were 32.4% and 65.4%, respectively, which was also statistically significan (P〈0.01). The rates of the cell proliferation detected by MTT of the transfected Lovo cellbook=2,ebook=44group and non⁃transfected group were 79.28% and 38.32%, respectively, which was extremely statistically significant (P〈0.001). Conclusion After being targeted with the siRNA, and transfected into the colorectal cancer Lovo cells and silenced specifically, the c⁃myc gene inhibits the proliferation and induces the apoptosis of colorectal cancer cells, and could provide more therapeutic targets for gene therapy of colorectal cancer.

［KEY WORDS］Survivin；hTERT；c⁃myc；Colorectal cancer；Lovo cells；Transfection；Apoptosis

基金项目：惠州市2012年科技计划（2012Y056）

通讯作者：刘集鸿，E⁃mail：liujihong251@163.com