丹红注射液改善糖尿病小鼠下肢缺血血管新生的研究

张争艳，王　鹏，伍　锋，吴宗贵

丹红注射液改善糖尿病小鼠下肢缺血血管新生的研究

张争艳，王鹏，伍锋，吴宗贵

中国人民解放军第二军医大学附属长征医院(上海200003)

摘要：目的 观察丹红注射液对糖尿病小鼠下肢缺血后血管新生的影响。方法 40只Balb/c小鼠，其中10只为正常对照组，30只采用链脲霉素腹腔注射联合左下肢股动脉结扎分离术制备糖尿病下肢缺血模型。模型小鼠中随机选取10只腹腔注射PBS作为Control组，10只腹腔注射丹红注射液作为DH组(2 μL/g，连续注射7 d)。采用激光多普勒血流灌注扫描仪观察血流灌注情况、动脉X线造影观察血管管样新生情况，及采集下肢肌肉组织匀浆，通过ELISA检测血管内皮生长因子(VEGF)表达量。 结果 与PBS对照组相比，丹红注射液显著增加糖尿病小鼠下肢缺血血流灌注、管样新生，并提高硫化氢浓度，VEGF表达量显著增高(P<0.05)。结论丹红注射液能改善糖尿病小鼠下肢缺血的血管新生，其可能机制是通过VEGF信号通路发挥作用。

关键词：糖尿病；下肢缺血；血管新生；丹红注射液；小鼠；血管内皮生长因子

中医“生脉”理论与治疗性血管新生密切相关，历代文献中均有“生脉”“生血”“生肌”等方面的论述。中医药能够作用于疾病发生的不同环节，不同阶段，多重功效相结合，从而达到促进血管新生的作用，这为缺血性心血管病的中医药研究提供了新的途径。丹红注射液(Danhong Injection，DH)为丹参、红花提取物按科学配方制备的中药复方制剂，指纹图谱结果显示其主要成分为多种丹参酮、丹参酸、红花黄素、红花酮苷等，具有活血化瘀、通脉舒络的功效，在临床上主要用于治疗心脑血管等缺血性疾病。研究表明，丹红注射液具有抗氧化、预防血栓形成、扩张血管、改善缺血再灌注损伤等功效[1-4]。

血管新生的起始步骤是血管萌芽，血管内皮生长因子(VEGF)与其受体VEGFR-2结合能够刺激顶端细胞动员并伸出丝状伪足，阻断VEGFR-2，血管萌芽过程明显抑制[5]。相反，VEGFR-1抑制后，能显著增加血管萌芽和管样形成，Chappell与其同事根据这一实验结果，猜测VEGFR-1在防止过度血管生成中发挥着重要生物学作用[6-7]。VEGF在血管新生中的重要作用毋庸置疑，VEGF的变化也被认为是药物干预血管新生的重要评估指标。治疗性血管新生为缺血性心脏病病人提供了一种崭新、有效的治疗方法，血管新生是一个涉及多因素、多环节的复杂过程。本研究旨在探索丹红注射液对糖尿病小鼠下肢缺血后血管新生的影响及可能机制。

1材料与方法

1.1试剂与药物丹红注射液：由菏泽步长制药有限公司提供，生产批号：国药准字Z20026866；链脲霉素(streptozotocin，STZ)购于美国Sigma-aldrich公司；1%戊巴比妥钠溶液购于德国Merck公司；0.1%mol/L柠檬酸缓冲液粉剂购于国药集团化学试剂有限公司上海分公司；Omnipaque造影剂：美国Amersham公司产品。mBBr (Monobromobimane)：货号M1813，美国Sigma公司产品；Sulfosalicylic acid；货号S2130，美国Sigma公司产品。

1.2仪器PIM 3 激光多普勒血流灌注成像仪：瑞典PERIMED公司产品；橱柜式小动物X光成像系统：MX-20，美国Faxitron公司产品；Waters2695高效液相色谱仪：美国Waters公司产品；Waters474荧光检测仪：美国Waters公司产品。

1.3动物饲养及分组40只Balb/c小鼠均于中国科学院上海药物研究所SPF级动物房分笼饲养，每5只一笼。所有的动物实验及手术方式符合中国科学院上海药物研究所动物使用与管理委员会的标准。中国科学院上海药物研究所SPF级动物房内换气次数(8～15)次/小时，氨浓度≤20 ppm，相对湿度40%～80%，滤过后空气为万级，温度(20～24)℃。40只小鼠随机分为4组，每组10只。Ⅰ组为单纯糖尿病对照组；Ⅱ组为糖尿病后肢缺血；Ⅲ组为糖尿病后肢缺血+PBS(2 μL/g×7 d，腹腔注射)组；Ⅳ组为糖尿病后肢缺血+DH(2 μL/g×7 d，腹腔注射)组。

1.4糖尿病小鼠下肢缺血模型制备小鼠饲养1周后，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ 150 mg/kg。糖尿病小鼠造模成功标准：出现多饮、多尿、多食及体重下降等糖尿病症状，连续2次随机血糖≥16 mmol/L。后于体视显微镜下，仔细分离出股动脉、旋髂外动脉、股动脉肌支和大隐动脉，用3/0号线结扎股动脉，留线头；其膝关节内侧，分离股动脉，用3/0号线结扎。将股动脉、股静脉和股神经分离开，抽剥两结扎点之间的股动脉，用细线缝合肌层和皮肤。制备糖尿病下肢缺血模型。术后观察肢体缺血情况，用以下评估参考分值来判断：肤色、皮温未发生明显改变计0分；坏死局限于脚趾计1分；坏死局限于足背计2分；坏死局限于小腿计3分；坏死范围波及大腿以上计4分。

1.5检测指标及方法

1.5.1激光多普勒血流灌注成像扫描评估下肢血流灌注情况第4周为实验终点。扫描前，用1%戊巴比妥钠 120 μL/20 g腹腔麻醉，双下肢呈“L”型。灌注比色刻度尺调整为0～400，扫描灵敏度调整为0.25，扫描小鼠腹部、下肢和尾部上端。采用LDPIwin 3.0软件分析血流灌注情况。

1.5.2X线动脉血管造影采用美国Faxitron橱柜式小动物X光成像系统MX-20进行X线动脉造影。抽取5 mL欧乃派克(Omnipaque)造影剂，将注射器插入左心室，快速推注造影剂。可见腹主动脉变白，拭去溢出的造影剂，置于橱柜式小动物X光成像仪中，进行X线扫描。扫描图片，选取髋关节到踝关节处整个后肢肌肉区域，采用Image J软件计算手术侧与非手术侧动脉造影评分(angiographic score)比率，评估血管侧支形成情况。

1.5.3下肢组织匀浆液抽提RNA检测VEGF mRNA和蛋白表达量采用Real-Time PCR测定组织中VEGF mRNA表达量。提取出的基因组DNA为模板，SYBR Green I为荧光标记物，进行实时定量PCR测定。以GAPDH为内参照，检测VEGF的相对表达量。扩增后目的基因相对表达量=2-(Cytokine Ct -GAPDH Ct)。公式内Cytokine系指目的基因，循环阈值Ct(cycle threshold)为目的基因cDNA达到指数扩增时的循环数。采用VEGF的ELISA试剂盒检测下肢组织匀浆中VEGF的量。

2结果

2.1糖尿病小鼠下肢缺血模型制备和鉴定40只小鼠均一次性腹腔注射STZ 150 mg/kg，成功率为100%，各组间血糖值无明显差异，各时间点测得血糖不作重复测量资料的方差分析(见表1)。手术后采用激光多普勒观察后肢缺血情况，显示相比于假手术侧，手术侧血流灌注明显下降(见图1)。

表1　各组随机血糖动态变化情况比较(±s) 　 mmol/L

注：1为手术侧(左侧)，2为假手术侧(右侧)；左侧为空白对照组，右侧为后肢缺血手术组。

2.2小鼠体重及手术侧下肢缺血情况的变化初始体重4组小鼠差别无统计学意义，实验期间体重随着时间的延伸呈规律性的变化，各时间点测得体重不作重复测量资料的方差分析(见表2)。将小鼠分为两组，A组为下肢缺血非糖尿病对照组(于实验第2周结扎下肢股动脉)；B组为糖尿病下肢缺血组(实验第0周STZ腹腔注射制备糖尿病模型，第2周结扎下肢股动脉)，结果显示糖尿病显著抑制下肢缺血后血流灌注的恢复(见表3)。

表2　各组小鼠体重动态变化情况(±s) 　 g

表3　各组激光多普勒血流扫描比值

2.3下肢缺血血管新生观察在糖尿病小鼠下肢缺血模型上观察到，与PBS对照组相比，DH能提高糖尿病下肢缺血后血流灌注、管样新生和微血管新生，差异具有统计学意义(P<0.05，见表4)。注射STZ后第3天，小鼠表现出多饮、多食、多尿等症状。下肢缺血模型完成后第1周(实验第3周)，4组小鼠下肢手术侧均出现不同程度干性坏疽，其后出现不同层面的肢体离断，以足趾及下肢远端离断最为常见，等级资料的多个样本非参数检验结果显示，各组手术侧下肢缺血情况变化有差异(见表5)。

表4　各组干预后小鼠手术侧下肢缺血后血管新生情况(±s) 　 %

表5　各组第4周小鼠手术侧下肢缺血情况以及功能评估　只

2.4VEGF信号通路作用与PBS对照组相比，DH能提高糖尿病下肢缺血后局部VEGF的mRNA和蛋白水平表达量，差异具有统计学意义(P<0.05)。 详见表6。

表6　各组干预后VEGF的mRNA和蛋白比较(±s)

3讨论

缺血性疾病是一种进展性的疾病，25%病人最终需要进行血运重建治疗，5%～10%病人可能发展为重症下肢缺血(critical limb ischemia，CLI)[8]。当缺血性疾病合并糖尿病时，CLI发病率明显增高，由于这种类型的CLI治疗手段有限，主要是外科手术、药物治疗，给社会和家庭带来沉重的负担[9-11]。外科手术虽然短期疗效立竿见影，在很长的一段时间被认为是治疗此类疾病最经典的方法，但是其长期并发症多，部分病人只能面临严重缺血导致的截肢，最终影响病人的生活质量，尤其是当病人伴有糖尿病时，手术疗效相对较差[12]。药物治疗起效慢，效果不甚显著。糖尿病状态下，高糖诱发的多种有害因素刺激，使机体蛋白质、脂类和核酸，在非酶促的条件下，形成结构稳定和不可逆的AGEs，使许多组织和血浆蛋白的结构和功能发生改变造成组织损伤和功能障碍，最终影响药物疗效[13-15]。本研究也证实，缺血性疾病合并糖尿病，内源性血管新生修复机制障碍。随着干细胞研究的逐渐深入，以干细胞为基础的治疗性血管新生越来越受到重视，干细胞移植到CLI病人机体，促进缺血组织血管新生，改善组织血液灌注，恢复其功能被认为是CLI又一新的治疗策略[16-19]。

VEGF的蛋白和基因治疗相关研究最为成熟，许多成果也已经应用于CLI治疗的临床前期。Lathi等[20]的Ⅰ期临床实验对69例CCS(3～4)级的难治性心绞痛病人进行裸VEGF-165 DNA基因治疗，SPECT可测得不管是在静息还是心肌负荷条件下，心肌灌注均有增加。提示基因治疗可以恢复或促进血管新生，增强心肌收缩力，使病人心绞痛症状有明显改善，心绞痛发作次数和硝酸甘油用量明显减少。然而，无论是VEGF蛋白及基因治疗，还是最新的细胞治疗技术，都存在明显的临床应用局限性。VEGF可能加速粥样斑块内血管生成导致斑块的扩张或破裂[21]，或通过刺激成纤维细胞及血管中层平滑肌细胞增生而促进冠状动脉狭窄的发展[22]。大剂量VEGF还可导致贫血、血小板减少、膜性肾病，最终诱发肿瘤、糖尿病性视网膜病变加重[23]。基因治疗中，裸DNA及非病毒载体转染效率低，持续时间短，而病毒载体则转染效率高，但存在激发异常免疫反应的危险。细胞治疗同样也存在一些问题，如采集骨髓步骤烦琐、需要骨髓量较大，由细胞移植引起细胞因子的释放从而导致心肌的损伤、心肌内肿瘤形成等。

中医药具有多靶点干预的特点，使其在促进治疗性血管新生临床转化中具有潜在的优势。中西医结合促进心血管病治疗性血管新生相关研究最为成功的中药，莫过于麝香保心丸。研究表明，丹参和红花配伍能够改善缺血后氧化应激和炎症浸润，具有改善缺血后组织坏死的功效[24-25]。丹参为双子叶植物唇形科，干燥根及根茎入药，其味苦，性微寒，归心、肝二经，具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神之功效，是常用的活血化瘀中药，有效成分主要为脂溶性丹参酮类和水溶性苯酚酸类等。在鸡胚绒毛尿囊(chick chorioallantoic membrane，CAM)模型上，验证了丹红注射液具有促进血管新生的作用，其机制可能与促进VEGF分泌有关[26]。也有研究表明，丹红注射液能够改善脑缺血，抑制缺血再灌注后神经元的凋亡[3]，亦能促进心肌缺血后血流再灌，并且抑制再灌注诱导的心肌凋亡[27]。丹参和红花的配伍，单独使用就有可能取得促进缺血后血管新生的疗效，但是糖尿病后肢缺血的病人机体内源性修复功能极其微弱，单独辅以中医药治疗，只能缓解短期症状，难以改善病人的远期预后。

本研究结果显示，丹红注射液能够显著促进CLI的血管新生，改善病人预后。

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(本文编辑王雅洁)

Danhong Injection Improves Promotes Angiogenesis in Diabetic Mice with Lower Limb Ischemia

Zhang Zhengyan，Wang Peng，Wu Feng，Wu Zonggui

Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

Abstract：Objective To investigate effect and mechanism of Danhong injection (DHI) on angiogenesis in the diabetic hind-limb ischemia mouse model.MethodsThirty diabetic hind-limb ischemic model mice and ten normal mice，established by intraperitoneal (i.p.) injection of streptozotocin (STZ) or PBS and ligation/excision of femoral artery，then，twenty diabetic hind-limb ischemic model mice of all were evenly randomized to saline (control) and DHI i.p.injection (2 μL/g weight for 7days) groups.Limb perfusion recovery and femoral vessel regeneration and lower limb vascular endothelial growth factor (VEGF) expression were evaluated during intervention and after euthanasia，respectively. Results DHI i.p.increased ischemic limb perfusion and promoted collateral circulation generation without decreasing blood glucose level.Increased local VEGF expression contributed to beneficial effects of DH injection.(n=10，P<0.05).Conclusion The activation of local VEGF signal pathway might participate in pro-angiogenesis effects of DHI injection in diabetic hind-limb ischemia model mice，suggesting a potential therapy for diabetic patients with critical limb ischemia.

Key words：Danhong injection；diabetic hind-limb ischemia；angiogenesis；mice；vascular endothelial growth factor

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81130065，81503371)

通讯作者：吴宗贵，E-mail：wu_zonggui@yeah.net

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.10.007

文章编号：1672-1349(2016)10-1078-05

Corresponding Author:Wu Zonggui

(收稿日期：2016-02-20)

·基础医学论著/研究·