调心安神针法对室性心律失常模型兔心肌细胞Cx43磷酸化表达的影响

王　锐，郭　丽 ，李永春 ，崔华峰 ，安　娜

调心安神针法对室性心律失常模型兔心肌细胞Cx43磷酸化表达的影响

王锐1，郭丽1，李永春2，崔华峰1，安娜2

1.山东中医药大学附属医院(济南 250011)，E-mail：sdgli1015@sohu.com；2.山东中医药大学

摘要：目的观察调心安神针法对室性心律失常模型兔心肌细胞缝隙连接蛋白43磷酸化(connexin-43 phosphate，p-Cx43)的影响。方法采用兔耳缘静脉注射氯化钡的方法制作室性心律失常模型。40只新西兰兔随机分为对照组、模型组、针刺组、药物组，针刺组施以调心安神针刺法(取穴：灵台、神道、双侧内关、百会)，药物组给予心律平灌胃。实验完毕后取兔左心室，Western印迹技术及激光共聚焦显微镜对p-Cx43的表达进行分析。结果模型组p-Cx43表达最低，药物组、针刺组略高于对照组。结论上调p-Cx43的表达可能是该针法治疗心律失常的机制之一。

关键词：室性心律失常；调心安神针法；缝隙连接蛋白43磷酸化；兔

心肌细胞缝隙连接蛋白43(connexin-43 phosphate，Cx43)与心律失常的发生有密切的联系。Cx43的重构，包括Cx43 基因表达、数量及磷酸化水平的改变以及重新分布等，会导致心肌细胞间电活动的同步性、协调性改变，电传导速度及各向异性的改变等，从而诱发心律失常。笔者基于多年临床经验，由灵台、神道、内关、百会穴组成调心安神方，并施行特定的手法操作，治疗早搏取得了满意的疗效[1]。本实验采用兔耳缘静脉注射氯化钡的方法制作室性心律失常模型[2]，观察调心安神针法对其心肌细胞Cx43磷酸化水平的影响。

1材料与方法

1.1实验动物与主要试剂新西兰兔40只，体重1.5 kg～2.0 kg，雌雄各半，由山东省农科院提供，合格证号：SCXK(鲁)20090013。一抗：Beta-actin(博奥森，货号bs-0061R)，Cx43(博奥森，货号bs-8987R)，p-Cx43(博奥森，货号bs-3098R)；二抗：山羊抗兔(Goat anti-rabbit IgG/HRP，博奥森，货号bs-0295G-HRP)，山羊抗兔488荧光二抗(Invitrogen公司，货号A11034)。

1.2分组与建模40只新西兰兔按照随机数字表法分为对照组、模型组、针刺组、药物组，每组10只。10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉(心律平组给药1 h后)，仰位固定于兔固定台上。将针形电极插入四肢远端皮下，选择标准Ⅱ导联，待心电图稳定后沿耳缘静脉注射20%氯化钡10 mL/kg造成室性心律失常模型。药物组给予心律平40 mg/kg灌胃，其余各组不予处理。

1.3针刺方法参照中国针灸学会实验针灸专业委员会制订的“动物针灸穴位图谱”，针刺组于造模后即刻给予针刺内关、百会、灵台、神道。灵台、神道穴位于背部正中线上，分别为胸椎六、七及五、六棘突间，向上斜刺5 mm，用震颤法快速小幅度行针1 min后起针；百会穴向后平刺5 mm；内关穴位于前臂下1/6折点处内侧，桡、尺骨间隙中，双侧内关分别直刺5 mm，行针1 min后接电针治疗仪，疏密波，刺激强度以家兔上肢出现轻微颤动为度。各组均观察体表心电变化，留针至恢复正常心律后停止记录，拔出针电极，立即处死动物，取左心室。

1.4观察指标

1.4.1Western blot技术方法检测Cx43、p-Cx43将样品加入到PAGE的加样孔中，80 V电泳30 min左右，待溴酚蓝标记的样品带进入分离胶后，改至100 V继续电泳，直至溴酚蓝出胶后卸胶。Bio-Rad 湿法转移系统将蛋白从PAGE胶转移至PVDF膜，冰水浴中100 V转移2 h。将膜放置于脱脂牛奶封闭缓冲液中，室温下置于摇床上孵育1 h。弃去封闭液，按推荐的稀释比配制针对各蛋白的一抗加到膜上，室温孵育2 h或4 ℃过夜；用洗涤液洗膜4次，每次10 min。再按推荐比例稀释HRP偶联二抗，加入到膜上，室温孵育45 min；用洗涤液洗膜4次，每次10 min。配制ECL发光试剂，均匀铺于膜上，反应2 min后吸去，用Fusion FX化学发光成像仪扫描图像并分析。

1.4.2制备冰冻切片和激光共聚焦显微镜观察p-Cx43分布取左心室心肌组织，组织切片与心肌纵轴平行，制备8 μm厚的冰冻切片，丙酮-20℃固定5 min，以备免疫荧光标记。切片用双蒸水漂洗3次，每次漂洗2 min，然后用0.25%Triton X-100处理10 min，经PBS漂洗后用10%羊血清白蛋白封闭20 min，用1∶100稀释的Cx43和p-Cx43多克隆抗体4℃孵育过夜，用PBS漂洗3次，每次漂洗2 min，滴加1∶400稀释的IgG-FITC二抗，室温闭光孵育2 h，用PBS漂洗3次，每次5 min，甘油封片。当天用激光共聚焦显微镜(德国Zeiss，LSM780)观察，用488 nm波长激发FITC，发生光为519 nm绿光。每张切片取(4～6)个视野，选择细胞纵行走向区域进行观察并拍照。

2结果

2.1Western blot检测结果对照组Cx43蛋白表达最高，模型组最低，药物组略高于针刺组；模型组p-Cx43表达最低，针刺组、药物组略高于对照组。详见图1。

图1Vesternblot检测结果

2.2免疫荧光染色绿色荧光斑标记p-Cx43，蓝色标记细胞核。结果显示，对照组荧光斑形态清晰，分布均匀，在细胞端端连接处为主；模型组荧光斑明显数量减少，形态相对粗乱，端端分布减少，呈不均一分布；针刺组及药物组荧光斑数量增多，改变较少。详见图2～图5。

图2对照组免疫荧光染色图3模型组免疫荧光染色图4针刺组免疫荧光染色图5药物组免疫荧光染色

3讨论

正常情况下的心肌细胞间存在着磷酸化和去磷酸化两种状态的Cx43，但仅磷酸化的Cx43 构成有功能的缝隙连接通道[3]。持续缺血能够导致磷酸化Cx43水平下降而去磷酸化的Cx43水平升高，同时各种心律失常的发生率( 如室性期前收缩、室性心动过速和心室颤动等) 明显增加，表明缺血心肌中Cx43 的去磷酸化与心律失常的发生有关[4-5]；近年合成的抗心律失常多肽即通过上调Cx43的磷酸化水平而发挥抗心律失常作用[6]。本研究表明，耳缘静脉注射氯化钡造成兔室性心律失常模型，其左心室心肌细胞Cx43及p-Cx43表达均下降，调心安神针法及心律平皆能上调二者的表达，且对于p-Cx43的上调作用尤为明显。

心律平作为临床上最常用的抗心律失常药物，有轻度β-受体阻断作用和轻微的钙通道阻滞作用[7]。这可能是心律平通过降低细胞内Ca2+的浓度， Ca2+依赖性蛋白酶如蛋白激酶A、C、G(PKA、PKC、PKG)等都会受到抑制，由于这些蛋白激酶都参与连接蛋白的磷酸化过程[8]，从而增加了Cx43及p-Cx43的表达。

Cx43可能是构成穴位的主要物质基础之一，针刺后穴位处Cx43表达增加，激活了间隙连接通道，促进了Ca2+、环磷酸腺苷(cAMP)、三磷酸肌醇(IP3)或其他小分子物质快速传递至相应脏器，形成了“气至病所”的物质基础[9]，进而调节脏器功能。调心安神针法治疗室性心律失常取得较好的临床疗效，对于Cx43的调节，包括增加Cx43的表达及促进Cx43磷酸化，可能即是其作用机制之一。

参考文献：

[1]王锐，张宁宁，谭奇纹，等.针刺调心安神法治疗心脏过早搏动的临床研究[J].世界针灸杂志，2012，22(2)：34-37.

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[3]王荣，张存泰，阮燕菲，等.大鼠心肌急性缺氧时缝隙连接蛋白43 磷酸化水平的改变及心律失常肽10 对其影响[J].临床心血管病杂志，2007，23(5)：375-378.

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[5]王伟光，张权宇，曹钰琨，等.κ阿片受体可通过抑制β肾上腺素受体进而调节心肌细胞Cx43 发挥抗缺血再灌注性心律失常[J].中国药理学通报，2010，26(4)：471 - 476.

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[7]张家铨，吴景时，程鹏.常用药物手册[M].北京：人民卫生出版社，2007：388.

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[9]李得浩，景向红，杨丽娟，等.针刺对大鼠不同部位穴位Cx43表达的影响[J].中国针灸，2012，32(5)：431-434.

(本文编辑王雅洁)

Effect of Tiaoxin Anshen Acupuncture on the Expression of Myocardial Connexin-43 Phosphate in Rabits with Ventricular Arrhythmia

Wang Rui，Guo Li，Li Yongchun，Cui Huafeng，An Na

The Affiliated Hospital，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250011，Shandong，China

Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Tiaoxin Anshen acupuncture on the expression of myocardial connexin-43 phosphate(p-Cx43) in rabits with ventricular arrhythmia.MethodsForty rabits were randomly divided into four groups： the control group， the model group， the acupuncture group treated with Tiaoxin Anshen acupuncture(points selected Lingtai points， Shendao points， Neiguan points on both sides and Baihui points)，and the propafenone group treated with propafenone by intragastric.Rabits of the acupuncture group received treatment of.Left ventricle of all the rabbits were taken out to test p-Cx43 protein expression by western bolt and laser scanning confocal microscope.ResultsThe expression of p-Cx43 was lowest in the model group.The expressions of p-Cx43 in the acupuncture group and the propafenone group were slightly higher than that in the control group.ConclusionThe up-regulating the expression of p-Cx43 might be one of the therapeutic target spots of Tiaoxin Anshen acupuncture for ventricular arrhythmia.

Key words：Tiaoxin Anshen acupuncture；ventricular arrhythmia；connexin-43 phosphate；rabits

中图分类号：R541R245

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.10.009

文章编号：1672-1349(2016)10-1085-03

(收稿日期：2015-07-01)