高效液相色谱法同时测定骨疏灵颗粒中淫羊藿苷和β-蜕皮甾酮的含量

俞　吉,朱裕林,朱　瑞,桑　冉,李　宇,陈卫东

(1.安徽省淮南市朝阳医院药剂科，安徽 淮南　232001；2.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥　230012；3.蚌埠医学院第一附属医院药剂科，安徽 蚌埠　233004)

·方药研究·

高效液相色谱法同时测定骨疏灵颗粒中淫羊藿苷和β-蜕皮甾酮的含量

俞吉1,2,朱裕林3,朱瑞2,桑冉3,李宇2,陈卫东2

(1.安徽省淮南市朝阳医院药剂科，安徽 淮南232001；2.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230012；3.蚌埠医学院第一附属医院药剂科，安徽 蚌埠233004)

[摘要]目的 采用高效液相色谱法建立同时测定骨疏灵颗粒中淫羊藿苷和β-蜕皮甾酮含量的方法。方法 采用Waters BEH130 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相梯度洗脱，检测波长为260 nm。结果 淫羊藿苷和β-蜕皮甾酮分别在0.012 5～0.125 mg/mL(r=0.999 8)和0.005～0.15 mg/mL(r=0.999 6)范围内与峰面积呈良好的线性关系；平均加样回收率分别为99.69%和100.16%(n=6)，RSD分别为1.69%和1.43%(n=6)。结论 该方法简便、准确、重复性好，可为骨疏灵颗粒的质量控制提供实验依据。

[关键词]骨疏灵颗粒；淫羊藿苷；β-蜕皮甾酮；高效液相色谱法；含量测定

骨疏灵是安徽中医药大学方朝晖教授继承新安医学医家经验，在中医衰老基本病机理论研究基础上，采用具有益气、温阳、活血的淫羊藿、牛膝、黄芪、牡蛎组成的复方，其中淫羊藿为君药，牛膝为臣药[1]。《中华人民共和国药典》将淫羊藿苷和β-蜕皮甾酮分别作为淫羊藿[2]67-68和牛膝[2]306-307的定性定量的指标，且β-蜕皮甾酮的含量测定为《中华人民共和国药典》2010年版新增内容。目前，有关二者的高效液相色谱法测定尚未见报道。本实验以淫羊藿苷和β-蜕皮甾酮为考察指标，采用高效液相色谱法建立同时测定骨疏灵颗粒中淫羊藿苷和β-蜕皮甾酮含量的方法，所测色谱峰与相邻色谱峰均能得到良好的分离，对骨疏灵颗粒的质量控制具有重要意义。

1仪器与试药

1.1仪器Waters 1525-2849高效液相色谱系统，Waters BEH130 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；R-100N型旋转蒸发仪：郑州市长城科工贸有限公司；DZF-6050型真空干燥箱：上海博讯实业有限公司；AB135-S型十万分之一电子天平：格特勒-托利多仪器有限公司；KQ-300B型超声波清洁器：江苏省昆山市超声仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵：郑州市长城科工贸有限公司。

1.2试药乙腈：天津市大茂化学试剂厂，色谱纯；甲醇：Methanex，色谱纯；纯净水：杭州娃哈哈饮料有限公司。骨疏灵颗粒：为安徽中医药大学药学实验室自制，批号分别为160101、160102、160103；淫羊藿、黄芪、牛膝、牡蛎：均购自亳州市药材大市场，经安徽中医药大学刘鹤龄教授鉴定均符合2010年版《中华人民共和国药典》规定；淫羊藿苷对照品(批号 110737-200415)、β-蜕皮甾酮对照品(批号 111638-201304)：中国食品药品检定研究院。

2方法与结果

2.1溶液制备

2.1.1对照品溶液的配制精密称取经减压干燥至恒质量的淫羊藿苷、β-蜕皮甾酮对照品适量，各置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，超声处理20 min(功率200 W，频率40 kHz)，配成淫羊藿苷浓度为0.25 mg/mL、β-蜕皮甾酮浓度为0.15 mg/mL的溶液，再分别吸取5 mL置10 mL量瓶中，得对照品混合溶液。

2.1.2供试品溶液的配制按照发明专利处方配比[3]，取淫羊藿饮片15 g，牛膝饮片12 g,黄芪饮片20 g，牡蛎饮片8 g。淫羊藿与牛膝以8倍(第1次多加3倍)70%乙醇回流提取3次，每次2 h；黄芪与牡蛎以8倍(第1次多加1.5倍)水煎煮2次，每次1 h。将醇提取药液回收乙醇后与水提取液分别挥干浓缩，在减压干燥箱以55 ℃，-0.09～-0.1 Mpa条件下干燥至恒质量后混匀，取出标记批号。上述操作重复操作3次，得批号为160101、160102、160103骨疏灵颗粒3批。

取自制骨疏灵颗粒约1 g，精密称定，置于10 mL容量瓶中，精密加入纯净水定容，密塞，超声处理20 min(功率200 W，频率40 kHz)，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，取过滤液即得。

2.1.3阴性样品溶液取处方中除淫羊藿和牛膝外的其余药材，按骨疏灵颗粒的工艺制备不含淫羊藿和牛膝的阴性对照制剂，按照“2.1.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.2色谱条件采用Cosmosil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流速1 mL/min，检测波长260 nm，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸(B)溶液，运行时间为45 min，平衡时间为15 min，柱温30 ℃。梯度洗脱：0～20 min，17% A，83% B；20～22 min，17%→30% A，83%→70% B；22～38 min，30% A，70%→30% B；38～45 min，30%→17% A，30%→83% B。在上述条件下测定，结果淫羊藿苷、β-蜕皮甾酮分离度均大于1.5，且保留时间适宜，峰形良好。对照品、样品的高效液相色谱图见图1，样品色谱图中色谱与对照品色谱相同保留时间处有色谱峰，而阴性样品无相应峰，说明样品中其他成分对以上2个成分的测定无干扰。

图1β-蜕皮甾酮对照品(A)、淫羊藿苷对照品(B)、β-蜕皮甾酮与淫羊藿苷混合对照品(C)、供试品(D)、缺淫羊藿药材

对照(E)、缺牛膝药材对照(F)和缺淫羊藿和牛膝的阴性对照(G)的高效液相色谱图(1.β-蜕皮甾酮；2.淫羊藿苷)

2.3线性关系考察按上述色谱条件，将淫羊藿苷标准品制成0.012 5、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125 mg/mL，β-蜕皮甾酮标准品制成0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.15 mg/mL一系列浓度，依次进样。结果表明，淫羊藿苷在0.012 5～0.125 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为y=5×107x+114 499，r=0.999 8；β-蜕皮甾酮在0.005～0.15 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为y=3×107x-37 852，r=0.999 6。

2.4精密度测定精密吸取对照品混合溶液20 μL，按上述色谱条件连续进样6次，记录每个标准品的峰面积，结果淫羊藿苷、β-蜕皮甾酮的RSD分别为0.26%和0.35% (n=6)，符合定量分析要求。

2.5稳定性试验取同一批样品(批号 160101)，按照“2.1.2”项下方法制得供试品溶液，移取供试品溶液，依照高效液相色谱条件于0、2、4、8、12、24 h测定2种成分的峰面积。结果淫羊藿苷、β-蜕皮甾酮在24 h内的RSD分别为0.88%、0.91%、1.45%、1.69%、0.59%、0.71%、1.18%、0.51%，表明本样品中各个组分在24 h内稳定性良好。

2.6重复性试验取同一批样品6份，按照“2.1.2”项下方法制得供试品溶液，依照高效液相色谱条件进行测定，记录2个活性成分的峰面积。结果淫羊藿苷、β-蜕皮甾酮的RSD分别为1.11%和0.98%，表示该方法重现性良好。

2.7加样回收率试验先分别精密称取淫羊藿苷5.21 mg和β-蜕皮甾酮对照品2.13 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解，定容，摇匀，制备混合标准品储备溶液。再精密称取已知含量的样品粉末6份，每份0.5 g，精密称定，加入2 mL混合标准品储备溶液，按供试品溶液制备方法制备后，按上述色谱条件测定含量。计算回收率，结果见表1。

表1　加样回收率试验结果

2.8样品测定按“2.2”项下方法处理样品，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，进样，测定3批样品中淫羊藿甘和β-蜕皮甾酮的含量。结果批号为160101、160102、160103的3批样品，淫羊藿苷含量分别为2.01，2.03，2.02 mg/g，β-蜕皮甾酮含量分别为0.59、0.54、0.58 mg/g。

3讨论

3.1测定方法和仪器选择高效液相色谱仪普及率高，利用该仪器建立骨疏灵颗粒中淫羊藿苷和β-蜕皮甾酮含量测定方法，对仪器设备要求相对较低，较超高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱等仪器成本低，适用性广。

3.2色谱条件的选择目前未见有文献关于同时测定淫羊藿苷和β-蜕皮甾酮含量的报道。在200～400 nm波长范围内对淫羊藿苷和β-蜕皮甾酮对照品进行紫外扫描时，发现淫羊藿苷最大吸收峰为270 nm，β-蜕皮甾酮最大吸收峰为250 nm。但在具体实验中发现，无论选择250 nm或者270 nm，均不能满足对另一种物质的含量测定，干扰较大，因此最终选取检测波长为260 nm。同时经文献检索发现，淫羊藿、牛膝单味药材的含量测定所选用流动相多为乙腈-水[4-5]，少数选用甲醇-水作为流动相。本实验重点考察乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水溶液等作为流动相的色谱图，其中乙腈-0.1%磷酸溶液的色谱图中淫羊藿苷峰形较好，但用于β-蜕皮甾酮测定时，其峰形较差。后经多次优化筛选，最终确定选用甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相，按本试验选定的时间程序洗脱，β-蜕皮甾酮和淫羊藿苷色谱峰出峰时间适宜，与相邻峰的分离度较好，且峰形对称。

3.3提取方法的选择骨疏灵颗粒提取工艺目前分为醇提和水提两部分：淫羊藿、牛膝采用醇提工艺，该工艺中，以君药淫羊藿的主要有效成分淫羊藿苷为含量测定及提取工艺优化的指标[6-7]，对牛膝的主要有效成分β-蜕皮甾酮并未作考察。2010版《中华人民共和国药典》中提出使用正丁醇作为溶剂在超声条件下提取牛膝药材中β-蜕皮甾酮，也有学者以β-蜕皮甾酮为指标通过正交设计优化牛膝提取工艺[8]，其相应β-蜕皮甾酮转移率与本实验一致，证明骨疏灵颗粒提取工艺较为成熟。

牛膝中含有皂苷类、植物甾酮类、糖类、黄酮类等多种成分[9-12]，牛膝中甾酮类物质可促进骨样细胞增殖[13]，这与《中华人民共和国药典》以β-蜕皮甾酮作为怀牛膝的质量控制指标相一致。

牛膝在我国产地较多，四川、安徽、湖北、陕西等省均有生产，课题组早期曾选用安徽亳州产牛膝作为配伍药材，但进行含量测定时发现其中β-蜕皮甾酮含量较低，且液相色谱分析后发现其他物质含量较多。后经鉴别，发现该牛膝药材等级为四等，后又选用河南温县所产特级怀牛膝作为配伍药材，所得实验结果较为满意，由此可见道地药材的重要性。

4结语

骨疏灵是安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，本研究采用高效液相色谱法对骨疏灵颗粒中淫羊藿苷、β-蜕皮甾酮采用梯度洗脱，进行同时测定。该方法样品处理简便，方法准确，可为骨疏灵制定检测方法与治疗标准提供参考价值。

参考文献：

[1]方朝晖,鲍陶陶,费爱华.骨疏灵对骨质疏松症大鼠骨组织形态的影响[J].中成药,2007,29(4):587-588.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M]．北京:中国医药科技出版社,2010:67-68.

[3]方朝晖.骨疏灵胶囊及其制备方法：CN1634170[P/OL].2005-07-06.http://dbpub.cnki.net/grid2008/dbpub/detail.aspx?QueryID=15&CurRec=1&dbcode=SCPD&dbname=SCPD0407&filename=CN1634170.

[4]宋剑,李知遥,贾继明,等.不同品种淫羊藿药材的指纹图谱研究[J].现代中药研究与实践, 2010,24(5):16-18.

[5]郁红礼,殷放宙,陆兔林,等.中药怀牛膝的液相色谱指纹图谱研究[J].中华中医药学刊,2010,28(6):1311-1313.

[6]朱裕林,陈卫东,张冬梅,等.淫羊藿醇提取与水提取工艺的比较[J].中成药,2015,37(2):435-437.

[7]余晓晖,赵磊,侯嘉,等.不同提取方法对淫羊藿中总黄酮提取率的比较[J].中成药,2011,33(7):1257-1259.

[8]张留记,孙丹丹,屠万倩,等.不同产地怀牛膝β-蜕皮甾酮含量测定及指纹图谱研究[J].天然产物研究与开发,2013,25(4):500-505，510.

[9]马英,毕开顺,王玺,等.HPLC法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量[J].中草药,2000,31(6):427-428.

[10]时春娟,周永达,张剑波,等.牛膝多糖研究进展[J].中国新药杂志,2006,15(16):1330-1334.

[11]孟大利,侯柏玲,汪毅,等.中药牛膝中的植物甾酮类成分[J].沈阳药科大学学报,2006,23(9):562-564，576.

[12]卫修来,高昌琨,高建,等.怀牛膝中总皂苷含量测定[J].安徽医药,2007,11(5): 424-425.

[13]孙奋勇,潘秋辉,洪岸.牛膝促进成骨细胞增殖的作用与机理研究[J].中药材,2004,27(4):264-266.

Simultaneous Determination of Icariin and β-Ecdysterone in Gushuling Granule by High-performance Liquid Chromatography

YUJi1,2,ZHUYu-lin3,ZHURui2,SANGRan3,LIYU2,CHENWei-dong2

(1.DepartmentofPharmacy,HuainanChaoyangHospital,AnhuiHuainan232001,China; 2.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 3.DepartmentofPharmacy,TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,AnhuiBengbu233004,China)

[Abstract]Objective To establish the method of high-performance liquid chromatography (HPLC) for the simultaneous determination of icariin and β-ecdysterone in Gushuling Granule. MethodsHPLC was performed on a Waters BEH130 C18column (250 mm×4.6 mm, 3.5 μm) with a mobile phase of acetonitrile-0.1% formic acid solution as the mobile phase for gradient elution at a detection wavelength of 260 nm. ResultsThe concentrations of icariin and β-ecdysterone showed a good linear relationship with the peak area within 0.0125-0.125 mg/mL (r=0.999 8) and 0.005-0.15 mg/mL (r=0.999 6), respectively. The average recovery rates were 99.69% and 100.16%, respectively (n=6), and the relative standard deviations were 1.69% and 1.43%, respectively (n=6). ConclusionThis method is simple, convenient, and accurate and has good repeatability, and it can provide an experimental basis for the quality control of Gushuling Granule.

[Key words]Gushuling Granule; Icariin; β-Ecdysterone; High-performance liquid chromatography; Determination

基金项目：安徽省自然科学基金项目(1608085QH213)

作者简介：俞吉(1984-)，男，硕士研究生

通信作者：陈卫东，anzhongdong@126.com

[中图分类号]R284[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.03.024

(收稿日期：2015-12-01；编辑：张倩)