高分辨率显微内镜对食管鳞状细胞癌标本的成像研究*

舒娟，屈亚威，谈涛，张玲，刘敏黎，刘海峰

（1.辽宁医学院武警总医院研究生培养基地，北京100039；2.武警总医院消化科，北京100039）



高分辨率显微内镜对食管鳞状细胞癌标本的成像研究*

舒娟1，屈亚威2，谈涛2，张玲2，刘敏黎2，刘海峰2

（1.辽宁医学院武警总医院研究生培养基地，北京100039；2.武警总医院消化科，北京100039）

摘要：目的探索高分辨率显微内镜（HRME）对食管鳞状细胞癌（ESCC）标本成像的可行性。方法回顾性分析24例ESCC大体标本的正常食管黏膜和ESCC组织的HRME图片，总结图片特点，制定正常食管黏膜和ESCC组织的HRME诊断标准。在此基础上，对60例内镜下疑诊为鳞状细胞癌的活检标本进行HRME前瞻性研究，将HRME预诊断结果与病理结果比较，评估HRME对食管鳞状细胞癌的诊断价值。结果正常食管黏膜HRME特点为：细胞排列规则，细胞核圆而亮，大小一致，核间距正常，视野里细胞的数量基本一致；ESCC组织HRME特点为：细胞排列极其紊乱，失去极性，细胞核大小不一，核间距减小，出现了大量细胞核的叠加，细胞核增大，每个视野中都为杂乱分布的细胞核。对60例内镜下疑诊为ESCC的活检标本HRME成像后，HRME预诊断为正常食管黏膜4个，鳞状细胞癌52个，其他4个。病理检查后，诊断为正常食管黏膜3个，鳞状细胞癌53个，其他4个。经统计学分析，HRME对鳞状细胞癌诊断的敏感度、特异度、准确性、阴性预测值和阳性预测值分别为96.2%、85.7%、95.0%、75.0%和98.1%。结论HRME可以很好地区分正常食管黏膜和鳞状细胞癌组织，其能很好的对鳞状细胞癌标本进行成像。

关键词：高分辨率显微内镜；食管鳞状细胞癌标本；成像研究

食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的生命健康［1］。目前，内镜检查结合组织活检是诊断ESCC的金标准，但该诊断方法也有其局限性，如对内镜下疑诊为食管癌的患者需多部位取活检以免造成病变的漏诊，会造成许多不必要的活检，这不仅增加了患者检查风险和费用，也延长了检查时间［2-4］。因此，需要一种新的内镜成像技术，能够在内镜检查的同时能快速、准确且无创的做出病理学成像，这对内镜医师的即时诊断和患者的及时治疗具有重要意义。近年来，本组自主研发了一种新型的能进行即时组织病理成像的高分辨率显微内镜（high resolution microendoscopy，HRME）成像设备，这是一种新的即时组织病理学成像技术，前期研究结果表明，HRME能很好地区分消化道不同部位的正常黏膜，可以实现虚拟病理学成像。前期研究结果令人鼓舞，然而HRME对ESCC的成像研究国内尚未见相关报道。本研究拟使用HRME对ESCC大体标本进行成像观察，制定正常食管黏膜和鳞状细胞癌组织的HRME诊断标准。在此基础上，利用HRME对内镜下疑诊为ESCC的活检标本进行前瞻性研究，评估HRME对ESCC的诊断价值。

1　资料和方法

1.1一般资料

1.1.1研究对象包括2014年12月-2015年3月因ESCC就诊于本院胸外科行手术切除的大体标本24例和2015年3月-2015年9月就诊于本院消化内镜中心行内镜检查时疑诊为ESCC的活检标本60例为研究对象。所有患者均签署知情同意书。

1.1.2试剂和药品0.01%原黄素盐酸盐（美国Sigma公司）、0.9%生理盐水（辰欣药业股份有限公司）、链霉蛋白酶颗粒（北京泰德制药股份有限公司）和碳酸氢钠（北京泰德制药股份有限公司）等。

1.1.3成像设备自主研发的HRME成像系统，包括1根含30 000像元的长1.8 m的光纤、10×显微镜镜头、500 nm二向色镜、滤光片、三维组合平移台、科学级低温制冷CCD相机和计算机图像处理软件，成像过程中HRME摄取的图像以17帧/s的速度由CCD相机传输至计算机。见图1。

1.2研究方法

1.2.1标本的获取对于大体标本，选择肿瘤组织及切缘附近的正常食管黏膜的标本用于本研究中诊断标准的制定。对于内镜下疑诊为ESCC的患者，常规行组织活检。选择组织较完整、表面残渣少的活检标本用于前瞻性研究。

图1　HRME结构原理图和实物图

1.2.2标本预处理活检标本和大体标本均先用生理盐水缓慢冲洗，去除表面残留物；再用去黏液剂（链蛋白酶和碳酸氢钠混合溶液）冲洗，去除表面残留黏液。再次使用生理盐水冲洗，去除表面残留的去黏液剂，干棉球擦干，备用。

1.2.3HRME成像过程将组织展平置于成像板上，局部喷洒0.01%原黄素盐酸盐2.0～3.0 ml，染色剂在组织表面大约停留30 s后用缓冲盐水冲洗表面残留染料，干棉球轻轻擦干组织表面液体。将光纤头端以不同角度观察组织表面，留取清晰的图片用于分析。对于大体标本，在HRME的成像位点用光纤做一个压痕，以保证成像位点与活检位点一致。1.2.4病理检查HRME成像结束后，将所有成像后的活检标本用福尔马林固定，HE染色后常规病理学诊断。

1.3HRME图片质量控制

对于所得HRME图片进行严格筛查，每个标本留取质量最好的10张图片用于图片分析。筛查标准：①伪影面积未超过图像面积的30%；②没有大量的杂质覆盖在组织表面；③图片清晰且可视面积大于80%。

1.4HRME诊断标准的制定

由2名具有丰富放大内镜诊断经验的内镜主治医师回顾性分析24例ESCC大体标本的正常食管黏膜和鳞状细胞癌组织的HRME图片特征，包括细胞核大小、形态、排列方式、核间距和核密度等指标，如果他们出现意见不一致时则进行讨论，最终达成一致意见，最后制定正常食管黏膜和鳞状细胞癌组织的HRME诊断标准。

1.5HRME对ESCC诊断的前瞻性研究

根据上述制定的诊断标准，由2名不知病理结果与内镜诊断结果的内镜主治医师对60个活检标本的HRME图片进行预诊断，包括ESCC、正常食管黏膜和其他3部分。以病理结果为金标准，评估HRME对ESCC的诊断价值。

1.6统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。计数资料按照四格表法进行统计，计算HRME对ESCC诊断的敏感度、特异度、准确性、阳性预测值（positive predictive value，PPV）和阴性预测值（negative predictive value，NPV）。

2　结果

2.1一般情况

24例大体标本中，包括溃疡型9例、肿块型11例和缩窄型4例，病理检查后，诊断为中-高分化鳞癌4例、中分化鳞癌13例和中-低分化鳞癌7例，HRME成像的正常食道黏膜经病理检查后证实为正常黏膜。60例活检标本中，包括溃疡型27例、肿块型28例和缩窄型5例。

2.2HRME图片选择

24例大体标本共获得954张图片，经筛查后，留取480张图片用于制定HRME诊断标准，占50.3%。60例活检标本共获得1165张图片，经筛查后，留取600张图片用于HRME前瞻性研究，占51.5%。

2.3HRME诊断标准的制定

HRME通过观察细胞核大小、形态、排列方式、核间距、核密度等指标来区分正常食管黏膜和病变组织。具体见图2所示。正常食管黏膜：细胞排列规则，细胞核圆而亮，大小一致，核间距正常，视野里细胞的数量基本一致；ESCC：细胞排列极其紊乱，失去极性，细胞核大小不一，核间距减小，出现了大量的细胞核叠加，细胞核增大，每个视野中都为杂乱分布的细胞核。

图2　正常食管黏膜和ESCC组织的HRME和相应病理图片

2.4HRME前瞻性研究结果

利用HRME对60个成像位点成像后，根据前期制定的诊断标准，做出预诊断。HRME预诊断结果：正常食管黏膜4例，ESCC 52例，其他4例。病理检查后，诊断为正常食管黏膜3例，ESCC 53例，其他4例。经统计学分析，HRME对ESCC诊断的敏感度、特异度、准确性、阴性预测值和阳性预测值分别为96.2%、85.7%、95.0%、75.0%和98.1%。见表1 和2。

表1　HRME预诊断结果与病理诊断结果比较　例

表2　HRME对ESCC诊断结果例

3　讨论

分子影像学技术是近年来广泛应用于科研和临床的一种成像方法，与传统的解剖学成像模式不同，分子成像技术可以实现细胞水平的功能成像［5-7］。代表性的成像方法有正电子断层成像（positron emission computed tomography，PET）、单光子断层成像（single-photon emission computed tomography，SPECT）、共聚焦激光显微内镜（confocal laser endomicroscopy，CLE）和HRME等。对于PET、SPECT和CLE等的基础和临床研究取得了显著的成果，而对于HRME的研究尚处于临床前的起步阶段。

HRME是一种新的分子成像技术，能够对组织进行实时成像，从而实现细胞水平的组织成像［8-11］。HRME的成像原理是通过LED光源发出的激发光经滤光片过滤，形成455 nm的窄谱段激发光，经高分辨率光纤传导至喷洒染色剂的生物组织产生515 nm激发荧光。荧光信号再通过高分辨率光纤返回，由物镜放大，通过二向色镜将激发光和荧光分开，只将荧光传导至CCD芯片上进行成像，从而得到被检测组织的细胞学图像。该成像系统成像直径为720.0μm，空间分辨率为4.4μm，摄像速度为17 帧/s。近年来，国外学者对HRME进行了一些成像研究，结果表明HRME具有良好的应用前景［12-15］。借鉴国外学者的研究经验，本研究自主研制了一套HRME成像系统，并进行裸鼠移植瘤、人口腔黏膜、家兔胃肠道黏膜和人体消化道正常黏膜的成像研究，取得了很好的成像效果，这为进一步临床研究奠定了基础。

在前期研究基础上，本组进行了HRME对ESCC成像的可行性研究。研究中首次提出了ESCC的HRME诊断标准，表现为：细胞排列极其紊乱，失去极性，细胞核大小不一，核间距减小，出现了大量的细胞核的叠加，细胞核增大，每个视野中都为杂乱分布的细胞核。HREM对ESCC诊断标准的建立主要根据细胞排列方式和细胞核大小、形态及核间距等指标，这与组织病理学诊断依据一致，具有很高的可信度。为了进一步验证该诊断标准的可行性和准确性，本组对内镜下疑诊为ESCC的活检标本进行了前瞻性研究，根据制定的诊断标准，HRME对ESCC诊断敏感度、特异度和准确性分别为96.2%、85.7% 和95.0%，与病理比较具有较高的一致性，前瞻性研究结果也进一步证实了该诊断标准的可靠性。

本研究发现，部分诊断结果为其他的标本的HRME图片不同于ESCC和正常食管黏膜，特点介于两者之间，后经病理证实为癌前病变。目前本研究尚未对食管癌前病变进行回顾性研究，只是区分了正常食管黏膜和ESCC组织。对于癌前病变的相关研究，将是后续研究的重点，这有助于揭示正常黏膜-癌前病变-癌的序贯变化过程，对于探索食管癌的发生、发展具有重要意义。

上述研究结果展现了HRME对食管鳞状细胞癌诊断的良好应用前景，但本研究也有一些局限性，如：①本研究仅对活检标本进行成像，还未对在体组织进行成像，下一步准备改进成像设备对在体组织进行成像；②本装置为小视野成像，其视场直径仅为720.0μm，只能辅助宽视野内镜对病变性质做出进一步诊断；③本成像设备还不能对所观察组织的图片进行定量分析，定量分析软件还在研发中，目前对病变的诊断仅能靠内镜医师的主观判断，带有一定的主观性。

综上所述，HRME作为一种新兴的成像工具，可以对组织进行实时病理学成像［12-18］，从而很好地区分正常食管黏膜和ESCC组织，具有良好的应用前景。HRME作为一种即时的显微成像工具，可以在内镜检查的同时做出即时病理学诊断，这对于提高病变诊断准确性具有重要意义。

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（吴静编辑）

High resolution microendoscopy for esophageal squamous cell carcinoma specimens*

Juan Shu1，Ya-wei Qu2，Tao Tan2，Ling Zhang2，Min-li Liu2，Hai-feng Liu2
（1.Department of Gastroenterology，Liaoning Medical University and the General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces on establishment of unit raising base for postgraduate education，Beijing 100039，China；2.Department of Gastroenterology，General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces，Beijing 100039，China）

Abstract：Objective To explore the feasibility of high resolution microendoscopy in the imaging of esophageal squamous cell carcinoma specimen. Methods Retrospective analysis of 24 cases of esophageal squamous cell carcinoma of the gross specimens of normal esophageal mucosa and squamous cell carcinoma tissues HRME images，summarizes the image characteristics，develop HRME of normal esophageal mucosa and squamous cell carcinoma tissue diagnosis standard. Based on the developed diagnostic criter，we made a prospective study and the specimen from the suspected of squamous cell carcinoma in 60 cases. Comparing the prepressing diagnosis of HRME with the pathological results，aiming to evaluate the diagnostic value of HRME for ESCC. Results The characteristic of normal esophageal mucosa of HRME images：cells were arranged in an orderly manner，the nucleus was round，light and identical in size，the inter-nuclear distance was normal，and the number of cells in each field was similar；The diagnostic criteria for ESCC were as follows：cell arrangement was significantly disordered，cells had no polarity，the nuclei were of different sizes，inter-nuclear distance was reduced，nuclear overlapping was found in a large number of cells，the nuclei were enlarged，and disordered distribution of the nuclei was observed in each field. After imag－book=11,ebook=16ing，HRME was diagnosed as normal esophageal mucosa at 4 sites，squamous cell carcinoma at 52 sites，and the other at 4 sites. After pathological examination，the diagnosis normal esophageal mucosa was 3，squamous cell carcinoma was 53 and the other was 4. The sensitivity，specificity，accuracy，negative predictive value and positive predictive value of HRME in the diagnosis of squamous cell carcinoma were 96.2%，85.7%，75.0%，95.0%，98.1%，respectively. Conclusions HRME can distinguish normal esophageal mucosa and squamous cell carcinoma tissues and it can be used for imaging of squamous cell carcinoma specimen.

Keywords：high resolution endoscopy；esophageal squamous cell carcinoma specimen；imaging analysis

中图分类号：R735.1

文献标识码：A

DOI：10.3969/j.issn.1007-1989.2016.04.003

文章编号：1007-1989（2016）04-0010-05

收稿日期：2015-12-07

*基金项目：首都临床特色应用研究（No：Z141107002514099）

［通信作者］刘海峰，E-mail：haifengliu333@163.com