QKI基因多态位点与四川地区汉族人群冠心病的相关性分析

杨驭媒，毛元英，张 可，郑 翼(.成都市第六人民医院检验科，四川 成都 6005；.四川大学华西医院心内科，四川 成都 6004)

QKI基因多态位点与四川地区汉族人群冠心病的相关性分析

杨驭媒1，毛元英1，张 可1，郑 翼2
(1.成都市第六人民医院检验科，四川 成都 610051；2.四川大学华西医院心内科，四川 成都 610041)

目的 研究QKI基因单核苷酸多态性(SNP)位点与四川地区汉族人群冠心病(coronary heart disease，CHD)发病的相关性。方法 入选570例CHD患者和735例正常对照(NC)样本，通过病例-对照关联研究方法，选择QKI基因上4个标签SNP(rs7756185、rs6941513、rs7745161、rs7751144)，以单碱基延伸(SNaPshot)方法进行基因分型，并分析其与CHD的相关性。结果 QKI基因4个SNP位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05)。其等位基因频率在CHD组与NC组之间差异有统计学意义(均P<0.01)。通过单倍体型分析发现，这4个SNP位点处于同一个连锁不平衡区域，其风险单倍体型TGGG可以增加CHD易感性0.25倍(P= 0.0051)，而保护型的单倍体型GACA可降低CHD患病风险31%(P= 0.0003)。结论 QKI基因多态性位点与四川地区汉族人群CHD发病显著相关，其保护型等位基因可降低CHD的易感性。

QKI基因；单核苷酸多态性；冠心病；易感性

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease，CHD)严重危害人类健康。2013年，全球由冠心病导致的死亡人数超过800万，居所有死亡原因的首位[1，2]。在我国，CHD死亡率逐年上升；2014年，我国CHD死亡率城市为107.5/10万、农村为105.37/10万，仅次于脑卒中，居死亡原因第二位[3]。研究表明，CHD是由遗传因素、环境因素和不良生活习惯共同作用所导致的复杂疾病[4～6]，年龄、性别、吸烟、高血压、高血脂、高血糖、肥胖、缺乏体力活动以及过量饮酒等均与CHD的发生有关[7]，遗传因素也是CHD发生发展过程中的关键因子[8，9]。随着全基因组关联研究(Genome Wide Association Study，GWAS)方法的成功应用，超过50个染色体区域被报道与CHD相关[10，11]。包括与血栓形成、血管收缩/舒张、能量代谢、脂质代谢和炎症相关的多个基因/位点，其中9p21.3是比较公认的CHD易感区域[10～12]，但仍有部分研究结果因不同种族、不同地区人群以及不同研究方法而存在较大差异。最近，Abbas Dehghan等对15个欧洲人群，共计64297例研究对象：包含 3898例心肌梗塞(myocardial infarction，MI)患者和5465例 CHD患者，进行GWAS meta分析，发现6q26区域QKI基因上的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点rs6941513与心肌梗塞和CHD均显著相关[13]。该结果是基于欧洲人群的发现，在中国人群中还未见QKI基因与CHD相关性的报道。因此，本研究选取QKI基因上的4个标签SNP位点(包括rs7756185、rs6941513、rs7745161和rs7751144)，通过病例-对照关联研究分析这4个位点与四川地区中国汉族人群CHD发病的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2009年3月至2015年10月期间，四川大学华西医院和成都市第六人民医院确诊为CHD的住院患者570例为病例组(CHD组)，平均年龄55.2岁(37～86岁)，其中男性326例(57.2%)。CHD诊断标准依据国际心脏病协会/世界卫生组织临床命名标准化专题组联合制定的指南，或者冠状动脉造影阳性(显示有至少一支冠状动脉直径狭窄≥50%)。选取健康体检人群735例作为正常对照组(NC组)，平均年龄62.6岁(50～81岁)，其中男性399例(54.3%)。两组均为四川地区汉族人群，CHD组的血压、空腹血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白水平均高于NC组(P < 0.05)，一般资料比较见表1。本项研究经医院伦理委员会批准，所有调查和取样均征得受试者同意并签署知情同意书。

表1 两组一般资料比较

与对照组比较，*P< 0.05；**P< 0.01

1.2 生化指标检测 血浆总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、葡萄糖(GLU)测定：受试者过夜空腹(8小时以上)后采集静脉血；所有生化检测均在成都市第六人民医院检验科进行。

1.3 基因组DNA提取 采集受试者外周静脉血5 ml(EDTA抗凝)，加入0.2%NaCl溶液，振荡，置冰上15分钟，3000 rpm离心30分钟，弃掉上清液，用0.2%的NaCl溶液洗涤一次，加入10 mM Tris-HCl (pH=8.0)和10 mM EDTA (4 ml)，10% SDS，25 mg/ml的蛋白酶K和10 mg/ml的RNaseA，加入量分别为4 ml、16 μl和20 μl，混匀，37 ℃过夜孵育，加入4 ml酚/Tris溶液，混匀，3000 rpm离心10分钟，氯仿抽提两次，采集水相，加入l/10体积的3M NaAC (pH=5.2)，两倍体积的无水乙醇，使DNA沉淀，再用70%的乙醇洗涤两次以获得基因组DNA，溶解于TE溶液中，然后定量测定在260 nm的吸收率，计算DNA浓度，并将DNA工作液浓度校正至50 ng/μl，置于-20 ℃保存备用。

1.4 聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段 从基因组数据库网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db=snp&cmd)获取QKI基因4个SNP(rs7756185、rs6941513、rs7745161、rs7751144)位点周围的基因组序列，采用Primer 3.0在线软件辅助设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成(PCR引物序列见表2)。PCR 反应条件为：95 ℃预变性 5分钟，经(95 ℃ 30秒，57 ℃ 30秒，72 ℃延伸30秒)× 35个循环，72 ℃延伸7分钟，12 ℃保温。

表2 QKI基因4个SNP位点的PCR和SNaPshot引物序列

1.5 基因分型 采用单碱基延伸(SNaPshot)法。PCR产物纯化：9 μl PCR 产物(4个位点各2.25 μl)加入1 U碱性磷酸酶(美国Promega公司)以及1 U 核酸外切酶(英国Biolabs公司)，混匀，37 ℃ 30分钟，75 ℃ 15分钟。取纯化后的产物1μl，分别加入4个SNaPshot引物各0.2 μl(SNaPshot引物序列见表2)，SNPshot Multiplex试剂1μl(美国ABI公司)，ddH2O补足5 μl。反应条件：96 ℃1 分钟，经(96 ℃ 10秒，50 ℃ 5秒，60 ℃ 30秒)× 25个循环，12 ℃保温。5 μl上述产物中加入1 U碱性磷酸酶，混匀，37 ℃ 15分钟，75 ℃ 15分钟。取上步产物1 μl，加入HD 9 μl，ABI 3730XL测序仪检测基因型，通过Genemap软件读取基因分型情况。

1.6 统计学方法 所有统计分析使用SPSS 19.0统计软件。单倍型分析采用Haploview 4.2软件。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。Hardy-Weinberg 平衡、基因型、等位基因频率的组间分布比较采用χ2检验，应用多因素回归分析基因多态性与CHD的相关性。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 QKI基因SNP位点基因型分布情况 Hardy-Weinberg平衡检验结果显示，4个位点的基因型在CHD组和NC组中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05，表3)，说明本研究资料具有群体代表性。CHD和NC组间4个位点的基因型分布比较，差异均有统计学意义(均P< 0.01)；各自小等位基因的纯合子对于CHD的发生具有保护作用。见表3。

表3 两组QKI基因4个SNP位点中基因型分布情况

2.2 QKI基因SNP位点在CHD组和NC组间的等位基因频率比较 校正年龄、性别等参数之后，CHD患者(CHD)组和对照(NC)组QKI基因上4个SNP位点的等位基因频率比较，差异均有统计学意义(均P< 0.01)，见表4。

表4 两组QKI基因4个SNP位点等位基因频率比较

2.3 连锁不平衡和单倍体型分析 采用Haploview 4.2 软件对QKI基因4个SNP位点进行分析，结果显示，这4个SNP位点处于同一连锁不平衡区域(linkage disequilibrium block，LD)。进一步比较4个位点所组成的单倍体型发现，共产生6个单倍体型，其中风险单倍体型(H1：TGGG)可以增加CHD易感性0.25倍(P= 0.0051，表5)，而保护型的单倍体型(H2：GACA)则可降低CHD的患病风险31%(P= 0.0003)，见表5。

3 讨论

近年来，GWAS已经成功应用于多种复杂疾病的易感基因研究，包括老年黄斑变性、糖尿病、肺癌和结肠癌等。但关键问题是GWAS的结果是否适用于不同种族以及不同人群；因此，要鉴定出真正的疾病易感基因，还需要对GWAS结果在其他独立样本人群中进行验证。本研究针对最近的一项欧洲人群CHDGWAS meta分析的结果[13]，在四川地区汉族人群中进行了进一步的验证。选取QKI基因上4个SNP位点(rs7756185、rs6941513、rs7745161和rs7751144)在570例CHD组和735例NC组中进行基因分型，并对其基因型和等位基因频率在两组之间统计比较。发现这4个SNP位点均与CHD发病显著相关，其小等位基因可以降低CHD的易感性，本研究结果证实了欧洲人群的发现。

表5 QKI基因4个SNP位点的单倍体型分析

QKI基因编码QUAKING蛋白，是一类RNA结合蛋白，对基因表达起着关键性的调控作用[14，15]。功能学研究表明，QKI对血管平滑肌细胞的收缩具有重要调控作用，抑制QKI活性可以促进血管损伤时的纤维化进程[16]。QKI的RNA结合活性在单核细胞分化为巨噬细胞的过程中有着举足轻重的作用[17]。单核细胞转化为巨噬细胞时都伴随着QKI表达的降低，这在斑块内出血导致的动脉粥样硬化损伤中均能检测到。QKI的低表达同时也会延缓单核细胞分化为巨噬细胞的进程，干扰其形成泡沫细胞的能力，并且阻滞动脉粥样硬化损伤过程中单核细胞的渗透[17]。

结合这些功能研究和遗传学的结果，发现QKI在炎症反应过程中起着一定作用，可以作为心血管疾病潜在的治疗靶点。进一步研究QKI基因及其编码蛋白的功能和作用机理将有助于CHD的早期诊断及精准防治。

[1] GBD 2013 Mortality and Causes of Death Collaborators. Global，regional，and national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death，1990-2013：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013 [J]. Lancet，2015，385：117-171.

[2] Moran AE，Forouzanfar MH，Roth GA，et al. The global burden of ischemic heart disease in 1990 and 2010：the Global Burden of Disease 2010 study [J]. Circulation，2014，129(14)：1493-1501.

[3] 中国心血管病报告编写组. 《中国心血管病报告2015》概要[J]. 中国循环杂志，2016，31(6)：521-528.

[4] Chilton R. Pathophysiology of coronary heart disease：a brief review [J]. J Am Osteopath Assoc，2004，104(9 Suppl 7)：S5-S8.

[5] Pjanic M1，Miller CL，Wirka R，et al. Genetics and Genomics of Coronary Artery Disease [J]. Curr Cardiol Rep，2016，18(10)：102.

[6] McPherson R，Tybjaerg-Hansen A. Genetics of Coronary Artery Disease [J]. Circ Res. 2016，118(4)：564-578.

[7] Go AS，Mozaffarian D，Roger VL，et al. Heart disease and stroke statistics-2014 update：a report from the American Heart Association [J]. Circulation，2014，129：e28-e292

[8] Lloyd-Jones DM，Nam BH，D’Agostino RB，et al. Parental cardiovascular disease as a risk factor for cardiovascular disease in middle-aged adults：a prospective study of parents and offspring [J]. JAMA，2004，291(18)：2204-2211.

[9] Marenberg ME，Risch N，Berkman LF，et al. Genetic susceptibility to death from coronary heart disease in a study of twins [J]. N Engl J Med，1994，330(15)：1041-6.

[10]Deloukas P，Kanoni S，Willenborg C，et al. Large-scale association analysis identifies new risk loci for coronary artery disease [J]. Nat Genet，2013，45(1)：25-33.

[11]Nikpay M，Goel A，Won HH，et al. A comprehensive 1000 Genomes-based genome-wide association meta-analysis of coronary artery disease [J]. Nat Genet，2015，47(10)：1121-1130.

[12]Samani NJ，Erdmann J，Hall AS，et al. Genomewide association analysis of coronary artery disease [J]. N Engl J Med，2007，357(5)：443-453.

[13]Dehghan A，Bis JC，White CC，et al. Consortium. Genome-Wide Association Study for Incident Myocardial Infarction and Coronary Heart Disease in Prospective Cohort Studies：The CHARGE Consortium [J]. PLoS ONE，2016，11(3)：e0144997.

[14]Apponi LH，Corbett AH，Pavlath GK. RNA-binding proteins and gene regulation in myogenesis [J]. Trends Pharmacol Sci，2011，32：652-658.

[15]Chénard CA，Richard S. New implications for the QUAKING RNA binding protein in human disease [J]. J Neurosci Res. 2008，86：233-242.

[16]van der Veer E，de Bruin RG，Kraaijeveld A，et al. Quaking，an RNA-binding protein，is a critical regulator of vascular smooth muscle cell phenotype [J]. Circ Res，2013，113(9)：1065-1075.

[17]de Bruin RG，Shiue L，Prins J，et al. Quaking promotes monocyte differentiation into pro-atherogenic macrophages by controlling pre-mRNA splicing and gene expression [J]. Nat Commun，2016，7：10846.

Association Study between SNPs in the QKI Gene and Coronary Heart Disease in a Sichuan Han Chinese Population

YANGYu-mei1，MAOYuan-ying1，ZHANGKe1，ZHENGYi2
(1.ClinicalLaboratory，No.6People’sHospitalofChengdu，Chengdu610051，China；2.DepartmentofCardiovascularMedicine，WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041，China)

ZHENGYi

Objective To investigate the association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the QKI gene and coronary heart disease (CHD) in a Sichuan Han Chinese population. Methods Four SNPs (rs7756185，rs6941513，rs7745161 and rs7751144) in the QKI gene were genotyped by the SNaPshot method in a cohort composed of 570 patients with CHD and 735 normal controls of Han Chinese descent. Results All the genotype frequencies of these SNPs were in Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) (P> 0.05). We found that these four SNPs were significantly associated with CHD in this cohort (均P< 0.01). These four SNPs were in the same linkage disequilibrium (LD) block. The risk haplotype TGGG generated by the four SNPs showed significant association with CHD (P= 0.0051，OR=1.25)，and the protective haplotype GACA also showed significant association with CHD (P= 0.0003，OR=0.69) in this cohort. Conclusion Our results suggest that genetic variants in the QKI gene were significantly associated with CHD in the Sichuan Han Chinese population.

QKI gene；single nucleotide polymorphism；coronary heart disease；susceptibility

国家自然科学基金资助项目(编号：30900626)

郑 翼

R541.4；R394.3

A

1672-6170(2016)06-0019-04

2016-05-11；

2016-10-25)