人星状病毒临床分离株感染CaCo-2细胞的转录组分析

吴立梦，滕峥，刘晶，张曦，崔晓娴，林庆能，吴寰宇，袁政安，谢幼华

1.上海市疾病预防控制中心，上海 200336；2.复旦大学基础医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032



*同为第一作者

人星状病毒临床分离株感染CaCo-2细胞的转录组分析

吴立梦1,2,*，滕峥1,*，刘晶2，张曦1，崔晓娴2，林庆能1，吴寰宇1，袁政安1，谢幼华2

1.上海市疾病预防控制中心，上海 200336；2.复旦大学基础医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032

摘要：人星状病毒(human astrovirus，HAstV)是引起婴幼儿病毒性腹泻的重要病原之一，但其致病机制及与宿主相互作用的数据非常有限。本研究旨在了解HAstV感染细胞后对宿主基因在转录水平上的影响。首先，利用临床分离HAstV毒株感染CaCo-2细胞，用实时定量反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测细胞培养上清液中的病毒总RNA，结果显示接种后9～24 h病毒总RNA拷贝数明显增加。然后，利用转录组测序全面比较感染与未感染HAstV的CaCo-2细胞转录本，筛选两者间的差异表达基因；并应用KEGG信号通路富集性方法分析差异表达基因相关的信号通路。结果显示，差异基因富集在两条信号通路上(P<0.05)，分别为轴突导向通路和Ras信号通路。本研究首次利用深度测序技术分析了HAstV感染对宿主基因在转录水平上的影响，为进一步研究HAstV致病机制等提供了方向。

关键词：人星状病毒；转录组测序；转录组

人星状病毒(human astrovirus，HAstV)是病毒性腹泻的重要病原之一，可导致急性胃肠炎，主要感染5岁以下婴幼儿，也可感染老人及免疫缺陷患者[1-4]。HAstV主要通过粪-口途径传播，既可引起散发性腹泻，也可引起暴发性腹泻，目前还没有疫苗及有效药物。

HAstV是无包膜单股正链RNA病毒，属于星状病毒科。病毒颗粒直径为28～30 nm，基因组全长约为6.8 kb，包括3个开放读码框架(open reading frame，ORF)——ORF1a、ORF1b、ORF2，2个非编码区(5′非编码区、3′非编码区)，1个多聚腺苷酸尾。其中ORF1a与ORF1b之间有71个核苷酸的重叠区；ORF1b相对保守，5′端无起始密码，蛋白翻译通过核糖体在重叠区的读框移码而实现；ORF2是变异相对较高的区域[5]。ORF1a 和ORF1b分别编码丝氨酸蛋白酶和 RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，ORF2编码衣壳蛋白的前体蛋白。HAstV主要分为经典HAstV及新型HAstV。根据ORF2部分区段，可将经典HAstV分为8个基因型HAstV-1～HAstV-8[6]。新型HAstV包括AstV-MLB、AstV-VA及HMOAstV-A、HMOAstV-B、HMOAstV-C等新发现病毒[7]。

本研究从临床粪便标本中成功分离了经典HAstV——HAstV-1、HAstV-2和HAstV-5，首次利用转录组测序(RNA sequencing，RNA-seq)全面比较了感染与未感染HAstV的CaCo-2细胞转录本，筛选两者间的差异表达基因，获得上调和下调差异基因共384个。应用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)信号通路富集性方法分析差异表达基因相关信号通路，提示差异基因富集在统计学上有意义的两条通路上，为今后HAstV致病机制及宿主免疫反应等研究提供了方向。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1临床粪便标本和细胞10份HAstV阳性标本均来自急性胃肠炎患者。实时反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)确定HAstV核酸阳性，同时排除细菌、轮状病毒、诺如病毒、肠道腺病毒、扎如病毒感染。人结直肠腺癌细胞CaCo-2(ATCC HTB37)购自中国科学院细胞库。

1.1.2主要试剂与设备DMEM培养基(高糖)、胎牛血清、谷氨酰胺、青/链霉素、0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)消化液均购自Gibco公司，胰酶(CAS：9002-07-7)购自生工生物工程(上海)股份有限公司，QIAamp NA Kit试剂盒为德国Qiagen公司产品，HAstV核酸测定试剂盒购自上海之江生物科技股份有限公司，Reverse Transcription System购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，Premix TaqTM购自宝生物工程(大连)有限公司。主要设备包括自动核酸提取仪(Roche公司)、LightCycler480实时荧光定量PCR仪(Roche公司)、CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1从粪便标本中分离病毒CaCo-2细胞(35代之内)培养于含10%胎牛血清、4 mmol/L谷氨酰胺及青/链霉素双抗液的DMEM培养基。培养条件为37 ℃、5% CO2、相对湿度90%。

在1 g粪便标本中加入9 mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，添加3 mm玻璃珠后剧烈混悬，4 ℃ 5 000 离心30 min，取上清液加入胰酶至终浓度为10 μg/mL，37 ℃孵育1 h。胰酶激活后的标本液接种于75%～90%融合的单层CaCo-2细胞，孵育30 min。吸去标本液，加入含3 μg/mL胰酶的无血清DMEM维持液，于37 ℃、5% CO2、相对湿度90%条件下培养1～3 d。

1.2.2细胞培养上清液中病毒总RNA检测病毒接种后6、9、12、18、24、40 h各取200 μL培养液，提取总核酸，终体积为100 μL。病毒标准品用DEPC处理后的无菌双蒸水10倍系列稀释。分别取5 μL病毒核酸和标准品，按荧光定量测定试剂盒说明书要求配制反应液，在 LightCycler480实时荧光定量PCR仪上进行扩增。用LightCycler480 Software Version 1.5.1软件绘制绝对定量标准曲线并分析结果。

1.2.3细胞培养上清液中病毒负链RNA和正链RNA检测病毒接种后6、9、12、18、24 h各取200 μL细胞培养液，抽提RNA，方法同上。用链特异性RT-PCR检测细胞培养上清液中病毒负链RNA〔(-)RNA〕和正链RNA〔(+)RNA〕。正向引物：Mon340(5′-CGTCATTATTTGTTGTCATA-CT-3′)；反向引物：Mon348(5′-ACATGTGCTG-CTGTTACTATG-3′)。操作步骤按说明书进行。

1.2.4HAstV基因型分析临床粪便标本按1.2.1所述接种CaCo-2细胞后24 h取细胞培养上清液，抽提病毒RNA，RT-PCR扩增ORF1b/ORF2片段。正向引物：PRECAP(5′-GGACTGC-AAAGCAGCTTCGTG-3′)；反向引物：82b(5′-GTGAGCCACCAGCCATCCCT-3′)。扩增产物长 719 bp，位于ORF1b与ORF2交界区[9]。PCR产物TA克隆后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。用MEGA6.06软件绘制系统发育树，确定 HAstV分离株的基因型。

1.2.5RNA-seq前标本处理、基因文库构建将未感染和感染 human astrovirus 5 Shanghai/0220/2014/CHN株的CaCo-2细胞于37 ℃、5% CO2、相对湿度90%条件下培养24 h。吸去细胞培养液上清液，用TRIzol提取细胞总RNA，RNA浓度和质量分别用NanoDrop 2000和Agilent2200检测。用Ion Total RNA-Seq Kit v2制备用于测序的基因文库。从5 μg RNA中富集mRNA，用RNase Ⅲ将mRNA片段化后纯化，片段化的RNA与Ion adaptor杂交并反转录扩增为双链cDNA，以cDNA文库为模板进行微乳液PCR(emulsion PCR)后在Ion PITM芯片上深度测序。

1.3生物信息学分析

用MapSplice软件[10]将测序后≥50 bp的原始reads进行外显子分析拼接，比对到参考基因组上。过滤比对后的数据，统计过滤后数据信息并计算基因的表达量、覆盖率、长度等，查看reads在参考基因组上的分布情况，计算两个样本之间基因表达量的相关性，并筛选两个样本之间的差异基因[11]。最后对筛选出来的差异基因进行聚类分析，对差异基因进行Pathway功能富集分析[12-13]

2结果

2.1HAstV感染细胞后培养上清液中病毒RNA变化情况

收集病毒接种后各时段的细胞培养上清液，用实时定量RT-PCR检测病毒总RNA变化。由图1可见，接种后9～12 h病毒总RNA增加最明显，接种后12～24 h增加稍缓，表明病毒成功感染CaCo-2细胞。用链特异性RT-PCR分析病毒(+)RNA和(-)RNA，发现感染后12 h即可在培养上清液中检测到(+)RNA，且随着培养时间延长，PCR产物条带亮度增加，提示上清液中病毒(+)RNA增加；而(-)RNA直到感染后24 h才出现在培养上清液中(图2)。

图1细胞培养上清液中病毒总RNA变化情况

Fig.1Detection of viral total RNA in the culture medium

图2RT-PCR检测病毒(+)RNA和(-)RNA变化

Fig.2Detection of HAstV(+)RNAs and(-)RNAs by RT-PCR

2.2临床标本中HAstV基因型的分析

从临床标本中分离培养获得4株HAstV：s1、s2、s3和s7。针对这4株病毒，通过RT-PCR扩增ORF1b与ORF2交界区域片段，测定核苷酸序列，绘制系统发育树。确定s3和s7毒株为HAstV-1，s2毒株为HAstV-2，s1株为HAstV-5，命名为human astrovirus 5 Shanghai/0220/2014/CHN(图3)。

Bootstrap values obtained from 1 000 replicates were shown.Scale bar indicates nucleotide substitution per site.The HAstV reference strains included in this analysis are obtained from GenBank(strain name/accession number).Viruses characterized in this study are marked with filled triangle.

图3利用ORF1b与ORF2交界区域部分序列核苷酸绘制的进化树

Fig.3A neighbor-joining tree constructed using MEGA 6.06

2.3HAst-5感染CaCo-2细胞后宿主基因转录组测序结果

2.3.1RNA-seq测序质量和reads在参考基因组上的分布概况利用RNA-seq分析human astrovirus 5 Shanghai/0220/2014/CHN株感染CaCo-2细胞后引起的宿主转录组变化，分析不同标本的基因表达量、比对到参考基因组上的覆盖率、reads在染色体上的分布等(表1、图4～5)。

2.3.2HAstV感染后转录组差异基因的筛选采用每百万reads中来自某一基因每千碱基长度的reads(reads per kilo bases per million reads，RPKM)来计算基因表达量，对测序深度和基因长度进行归一化，剔除测序深度总库容量和不同基因长度的影响，计算获得基因表达量，进而比较不同样本间基因表达量差异。HAstV感染后转录组差异基因筛选标准为：差异倍数(fold change)≥1.5(P<0.05)，共筛选出354个差异表达基因，包括177个表达上调的基因和177个表达下调的基因。表2～3列出差异倍数位于前20位的上调和下调基因。

表1RNA-seq分析感染和未感染HAstV的CaCo-2细胞原始数据分布

Tab.1Statistics of raw and mapped reads from RNA-seq analysis of CaCo-2 cells with or without HAstV infection

S24NC24Rawreads1782297217773814Unmappedreads32394212760236Mappedreads(rate)14583551(0.818)15013578(0.845)Uniquemapping(rate)14065367(0.789)14429738(0.812)Repeatmapping518184583840

S24,cells at 24 h after HAstV-5 infection;NC24,cells at 24 h without HAstV-5 infection.

图4与参考基因组比对后的reads在外显子、内含子、5′-UTR、3′-UTR、转录起始位点、转录终止位点和基因间隔区的分布比例

Fig.4Percentages of mapped reads onto the regions of exons,introns,5′-UTR,3′-UTR,transcription start site(TSS),transcription end site(TES)and intergenic region

图5Reads在染色体上的分布

Fig.5Distribution of reads on chromosomes

2.3.3KEGG信号通路富集性分析KEGG信号通路富集性分析发现，HAstV感染CaCo-2细胞后差异表达基因主要富集在两条信号通路上(P<0.05)，分别是轴突导向通路和Ras信号通路(表4)。

表2HAstV感染CaCo-2细胞后的转录上调基因

Tab.2Up-regulated genes in HAstV-infected CaCo-2 cells control cells

〛GenesymbolDescriptionFoldchange(log2)RNF112cDNAFLJ52256,highlysimilartozincfingerprotein1792.43NRTNNeurturin2.42ANGPTL4Angiopoietin-relatedprotein42.27HMGN1P4Highmobilitygroupnucleosomebindingdomain1pseudogene42.19RAET1LRetinoicacidearlytranscript1Lprotein2.18LOC149351UncharacterizedLOC1493512.16KCNQ2cDNAFLJ60440,highlysimilartopotassiumvoltage-gatedchannelsubfamilyKQTmember22.04STC1cDNA,FLJ92965,highlysimilartohomosapiensstanniocalcin1(STC1)mRNA2.00DHRS2Dehydrogenase/reductaseSDRfamilymember2,mitochondrial2.00SNORD3B-1SmallnucleolarRNA,C/Dbox3B-11.99RPS29P3RibosomalproteinS29pseudogene31.88EPHA10Ephrintype-Areceptor101.88HPCAL4cDNAFLJ61110,highlysimilartohippocalcin-likeprotein41.84RPL37P2RibosomalproteinL37pseudogene21.82PPFIA4Liprin-α-41.70FLRT1Leucine-richrepeattransmembraneproteinFLRT11.64TPPPTubulinpolymerization-promotingprotein1.60TOX2TOXhighmobilitygroupboxfamilymember21.58RPS2P11RibosomalproteinS2pseudogene111.55NKX6-1HomeoboxproteinNkx-6.11.54

表3HAstV感染CaCo-2细胞后的转录下调基因

Tab.3Down-regulated genes in HAstV-infected CaCo-2 cells control cells

〛GenesymbolDescriptionFoldchange(log2)CD99CD99antigen-8.09LOC80154Putativecoloncancer-associatedantigenSK1-5.84RPL18P3RibosomalproteinL18pseudogene3-4.96GJD2Gapjunctionprotein-3.91CCL26Chemokine(C-Cmotif)ligand26-3.91CST2Cystatin-SA-3.71RPS26P8RibosomalproteinS26pseudogene8-3.52GPRIN2Gprotein-regulatedinducerofneuriteoutgrowth2-3.33CTBP2P1C-terminalbindingprotein2pseudogene1-3.26ITGB1BP2Integrinβ1-bindingprotein2-3.10NBPF24Neuroblastomabreakpointfamily,member24-2.93CIRBP-AS1CIRBPantisenseRNA1-2.67BATFBasicleucinezippertranscriptionfactor,ATF-like-2.60GNB3Guaninenucleotidebindingprotein(Gprotein),βpolypeptide3-2.59ANAPC1P1Anaphasepromotingcomplexsubunit1pseudogene1-2.53HFM1ProbableATP-dependentDNAhelicaseHFM1-2.51MIR3687microRNA3687-2.40PSAT1P4Phosphoserineaminotransferase1pseudogene4-2.21TK2TK2protein-2.20SIRPB1Signal-regulatoryproteinβ1isoform3-2.07

表4KEGG分析HAstV感染CaCo-2细胞后差异表达的基因

Tab.4KEGG analysis of differentially expressed genes in HAstV-infected CaCo-2 cells

PathwayIDPathwaytermPvalueDifferentiallyexpressedgenePATH:04360Axonguidance0.0091NGEF,DPYSL5,EFNA3,EPHB2,EFNB1,SEMA6BPATH:04014Rassignalingpathway0.0196GRIN1,ANGPT2,GAB1,RASA4,NGFR,PLA2G4F,RRAS,EFNA3,GNB3

3讨论

1990年，Willcocks等采用传代细胞系人结肠癌CaCo-2细胞直接从粪便标本中分离 HAstV并获得成功，后续研究均以CaCo-2细胞作为HAstV培养的标准细胞系[14]。CaCo-2细胞来源于人结肠癌细胞，其结构、生理和生化性质类似于人小肠上皮细胞，具有微绒毛结构。该细胞感染模型可用于HAstV进入细胞[15]和宿主产生免疫应答[16]的机制研究。

本研究从10份临床粪便标本中成功分离培养4株HAstV，根据ORF1b与ORF2交界区域核苷酸序列绘制系统发育树，确定2株为HAstV-1、1株为HAstV-2、1株为HAstV-5。利用实时定量RT-PCR 和链特异性RT-PCR分析HAstV-5毒株感染CaCo-2细胞后各时段培养上清液中病毒总RNA及(+)RNA、(-)RNA变化情况，结果显示病毒RNA从感染后9 h开始迅速增加，增幅为100～1 000倍。HAstV基因组为单股正链RNA，病毒基因组进入细胞后分别合成病毒基因组和衣壳蛋白，包装成病毒颗粒后释放到胞外，继续感染其他细胞。图2显示感染后12 h即可检测出胞外上清液中存在(+)RNA，(-)RNA则在感染后24 h出现，可能为病毒感染导致细胞凋亡破裂后释放的胞内病毒基因组复制中间产物。

本研究首次利用RNA-seq分析了HAstV感染CaCo-2细胞的转录组变化，分别筛选出上调和下调的差异表达基因。细胞感染病毒后下调基因的差异倍数变化较显著，如CD99、C-C趋化因子配体26〔chemokine(C-C motif)ligand 26，CCL26〕、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(basic leucine zipper transcription factor，ATF-like，BATF)等基因，后续工作将对其加以证实。BATF属于转录因子激活蛋白1超家族，激活的免疫细胞中BATF表达明显增高[17]，细胞感染病毒后BATF下调是否与HAstV感染后肠道炎症反应相关，还需进一步探讨。本研究应用KEGG信号通路富集性方法分析有统计学意义的信号通路，发现轴突导向通路和Ras信号通路是差异表达基因较显著富集的通路。其中Ras信号通路中发现9个差异表达基因，5个基因表达上调，4个基因表达下调。Ras信号通路在肿瘤研究中报道较多，在病毒研究领域报道较少。Zhang等[18]发现用V12(一种Ras持续性激活的突变体)激活的Ras/Raf/MEK通路能促进丙型肝炎病毒复制。Real等[19]发现丙型肝炎病毒携带者的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与等基因相关。HAstV感染CaCo-2细胞后是否导致Ras信号通路变化而促进病毒复制还需进一步验证。

长期以来，HAstV的致病机制及其临床重要性未得到充分重视。近几年来，随着分子生物学技术和生物信息学的发展，人们对星状病毒的研究逐渐深入，但国内研究者对HAstV致病机制的研究还很少。HAstV可感染多种宿主，是婴幼儿急性病毒性胃肠炎的主要病毒，对其复制机制、致病机制、与宿主相互作用及机体免疫应答等的研究还需进一步深入。

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Transcriptome analysis of clinically isolated human astrovirus in CaCo-2 cells

WU Limeng1,2,*,TENG Zheng1,*,LIU Jing2,ZHANG Xi1,CUI Xiaoxian2,LIN Qingneng1,WU Huanyu1,YUAN Zheng’an1,XIE Youhua2

1.Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention,Shanghai 200336,China;2.Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health,School of Basic Medical Sciences,Fudan University,Shanghai 200032,China

Abstract:Human astrovirus(HAstV)is one of the major causes of viral gastroenteritis in infants and young children.However,data on the host response to and pathogenesis of HAstV infection are limited.The primary goal of this study was to identify differentially expressed genes and enriched pathways associated with HAstV infection in human CaCo-2 cells.The clinical isolates of HAstV were used to infect CaCo-2 cells and total viral RNAs in the extracellular medium were quantitatively detected.Real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)assay was applied to clearly demonstrate a significant increase in the amount of viral RNAs in the culture supernatant at 9-24 h post-infection.Finally,RNA sequencing was performed to compare the transcriptomes of CaCo-2 cells infected with and without a clinically isolated HAstV strain.Statistical analyses on differentially expressed genes revealed that axon guidance and Ras signaling pathways were altered in HAstV-5-infected CaCo-2 cells(P<0.05).This is the first report on the deep-sequencing analysis of transcripts of CaCo-2 cells infected with HAstV.The data from this study can serve as a basis for future studies of HAstV pathogenesis.

Key words:Human astrovirus;RNA sequencing;Transcriptome

基金项目：“十二五”国家科技重大专项(2012ZX10004-211-03)，上海市第四轮公共卫生三年行动计划重点学科建设(15GWZK0101)

通信作者：谢幼华

Corresponding author.XIE Youhua,E-mail:yhxie@fudan.edu.cn

(收稿日期：2016-03-18)

·论著·