红麻肌醇加氧酶基因的分离及表达分析

张高阳+邓接楼+柯维忠+黄思齐+李德芳

摘要：干旱是限制植物生长分布和影响作物产量形成的重要非生物因素之一，在响应干旱胁迫过程中植物细胞壁发挥着重要的调节作用，肌醇加氧酶是植物细胞壁合成的前体物质UDP-葡萄糖醛酸合成中的关键酶。为研究该基因在红麻（Hibiscus cannabinus L.）抗旱和耐盐过程中的作用，通过红麻转录组数据库筛选到肌醇加氧酶（myo-inositol oxygenase）基因的核心片段，利用染色体步移技术获得肌醇加氧酶基因的cDNA全长，命名为HcMIOX；生物信息学分析表明，HcMIOX基因编码序列长948 bp，编码315个氨基酸，相对分子量为31.9 ku，等电点为4.75；RT-PCR分析表明，HcMIOX基因在红麻根、茎、叶中均有表达，根中表达量最高，该研究结果对分析该基因功能和了解红麻抗旱的分子机制具有重要意义。

关键词：红麻；转录组；肌醇加氧酶；分离；表达分析

中图分类号： S563.501 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0048-02

收稿日期：2016-04-01

基金项目：江西省教育厅科学技术研究项目（编号：GJJ151050））；中国农业科学院创新工程（编号：ASTIP-IBFC03）；上饶师范学院2014年博士科研启动基金（编号：001055）。

作者简介：张高阳（1982—），男，河南驻马店人，博士，主要从事植物生物技术研究。Tel：（0793）8153721；E-mail：gyzhang2015@163.com。

通信作者：李德芳，博士，研究员，主要从事农业生物技术研究。Tel：（0731）88998506；E-mail：chinakenaf@126.com。 干旱、盐碱和极端温度等是目前世界范围内严重影响作物生长发育和产量形成的主要非生物因素[1-2]。红麻（Hibiscus cannabinus L.）是锦葵科木槿属一年生草本韧皮纤维多用途经济作物，在我国广大地区都有种植，因其纤维可以与棉混纺而应用于纺织工业，越来越受到人们的重视。因此，通过基因工程技术培育红麻耐旱品种，在我国广大干旱地区种植，实现其不与粮争地等具有重要意义。

干旱胁迫下，植物叶片细胞生长受阻与细胞壁的硬化密切相关，可有效减少植物绿叶面积，进而明显降低绿叶的蒸腾失水。因此，植物细胞延伸生长与细胞膨压、细胞壁伸展性变化等，可在响应干旱胁迫过程中应对植物失水过程[3]。植物体内的肌醇在加氧酶作用下通过氧化还原生成UDP-葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸是植物细胞壁主要成分葡糖醛酸、木糖、芹菜糖和阿拉伯糖等合成的主要前体物质[4-5]。维生素C在植物体内不仅参与生长发育，还作为一种能清除超氧自由基的抗氧化剂，以缓解其对植物细胞造成的伤害。已有大量研究表明，抗坏血酸参与了对植物逆境胁迫下的保护作用，肌醇加氧酶基因在植物维生素C的生物合成中具有重要作用，在拟南芥中过量表达肌醇加氧酶基因，植物体内维生素C含量比对照提高了2～3倍，植株的抗旱性也能有所增强[6-7]。因此，可以认为该基因在应对植物干旱胁迫过程中发挥着重要作用。

有关该基因在植物中的研究，目前只见在水稻中有报道[8]，本研究旨在分离红麻肌醇加氧酶基因，并对其在各个组织中的表达情况进行分析，为今后了解该基因在植物干旱胁迫分子应答中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

红麻（Hibiscus cannabinus L.）抗旱品种“非引四号”保存于中国农业科学院麻类研究室，Taq plus DNA聚合酶、载体pMDl9-T、逆转录试剂盒（TaKaRa AMV Ver 3.0）、dNTPs均购自宝生物工程（大连）有限公司，感受态细胞DH5α保存于笔者所在实验室，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 红麻茎皮总RNA提取及引物设计 取田间生长旺盛的红麻茎皮组织，迅速放入液氮中带回实验室，按TaKaRa公司RNA提取试剂盒操作方法提取总RNA，以2 μL总RNA为模板，按TaKaRa公司反转录试剂盒反应体系和方法合成cDNA第1条链，并作为后续反应的模板。以从红麻转录组数据库中筛选的MIOX基因核心片段为基础，利用primer premier 5.0软件设计染色体步移引物，MIOX基因3′端扩增引物为3F1：（5′-TGACGAAACTGTCTGGAATCGC-3′），3F2：（5′-TTCGCTTACTCTACGGTTCACG-3′）；5′端扩增引物为5F1：（5′-CGGTGGTGAACATTTCGCTACAG-3′），5F2：（5′-GAAGTTACGGTGAGGAGCAGG-3′）。

1.2.2 红麻MIOX基因全长cDNA的克隆 红麻MIOXT基因3′末端扩增参照TaKaRa公司试剂盒。使用接头引物进行RNA反转录，然后通过与接头引物部分重叠的3′-OUT、3′-IN引物分别与基因特异性引物3F1、3F2进行巢式PCR，5′端克隆利用末端脱氧核苷酸转移酶法（TdT），在cDNA的3′末端加上1个多聚的dC尾，然后用5′-OUT、5′-IN以及基因特异性引物5F1、5F2进行巢式PCR，RT-PCR体系为25 μL，含无菌去离子水（17.5 μL）、10×PCR buffer（2.5 μL）、10 mmol/L dNTP Mix（2.5 mmol/L，2 μL）、上下游引物（10 μmol/L）各2.5 μL、10 U μL/L Taq（0.2 μL）、DNA聚合酶（2 U）。反應程序：预变性95 ℃ 3 min；变性94 ℃ 40 s，退火55 ℃ 50 s，延伸72 ℃ 3 min，35个循环；最后72 ℃延伸 10 min），PCR产物用天根生物有限公司琼脂糖胶回收试剂盒回收纯化，连入pMDl8-T载体，热激转化DH5α感受态细胞，菌落PCR和质粒酶切验证正确的单克隆送华大基因测序。利用DNAMAN软件拼接MIOXT基因的3′末端、5′末端和核心片段。endprint

1.2.3 红麻MIOX基因序列及表达分析 采用ProtParam分析HcMIOX基因的各种基本理化特性，采用在线软件NCBI ORFfinder寻找MIOXT基因的编码区及其推倒的氨基酸序列。红麻成长至50 d后，采用20%PEG6000诱导处理后分别取根、茎和叶组织中的RNA样品，红麻18S RNA为内参，对不同组织中的MIOXT基因进行半定量分析。

2 结果与分析

2.1 红麻RNA提取

红麻是一种富含多糖、多酚和其他次生代谢物质的植物，高质量的RNA获取比较困难，笔者参照陈美霞等的提取方法[9]，利用SDS法并稍作改进获得高质量的RNA，总RNA主带清晰，条带锋利，无明显降解，28S条带约为18S的2倍，提取的RNA浓度为876 ng/μL，D260 nm/D280 nm=2.02，其浓度和纯度较好，可满足下一步试验的要求。

2.2 红麻HcMIOX基因克隆

通过对红麻转录组数据库的筛选，获得红麻MIOX基因的核心片段，根据核心片段设计扩增该基因的5′端和3′端末端引物，在5′末端克隆中，以5′-IN和5′F2为引物扩增得到1条502 bp的片段，3′末端扩增反应中，以3′-IN和3′F2为引物扩增得到约213 bp的条带；最后利用基因特异引物扩增获得包括5′UTR部分序列的MIOX基因cDNA全长1 216 bp的片段（图1）。

2.3 红麻HcMIOX基因序列及表达分析

利用DNAMAN软件对测序结果进行拼接后得到948 bp的核苷酸序列，编码1段含有315个氨基酸的推导性蛋白质（图2），分子量为31.9 ku，等电点为4.75。图3表明，红麻HcMIOX在根、茎、叶中均有表达，在根中的表达量最高。

3 结论与讨论

肌醇加氧酶是植物細胞壁合成中前体物质UDP-葡萄糖醛酸和抗坏血酸的生物合成中的关键酶，在植物的逆境成长发育过程中，抗坏血酸起着重要的保护作用，有关植物肌醇加氧酶的研究只在水稻中有报道[4-6]。王海光等研究了不同

水稻肌醇加氧酶基因水分胁迫下的表达情况，结果表明，在旱稻（IRAT109）中OsMIOX基因的表达上调，在旱稻（IRAT109和毫格劳）中的表达量明显高于水稻（越富和日本晴）品种，这说明水稻和旱稻中存在不同的分子响应机制以应对水分胁迫[8]。肌醇加氧酶基因在红麻不同组织中都有表达，但根中表达量最高，水分胁迫直接影响着根部的生理代谢活动，很可能是因为红麻主要通过根部生理变化、基因表达来应对干旱胁迫。

本研究通过分析红麻干旱胁迫转录组数据，筛选到1个红麻受干旱胁迫诱导高效表达的基因（MIOX）片段，利用染色体步移技术获取该基因全长cDNA序列。生物信息学分析表明，HcMIOX基因编码序列长948 bp，编码315个氨基酸，相对分子量为41.8 ku，等电点为4.86。干旱胁迫诱导表达分

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析表明，MIOX基因在红麻根、茎和叶组织中均有表达，在根中的表达量最高。这是在纤维作物红麻中首次分离得到该基因，研究结果为下一步分析该基因的功能和了解红麻抗旱的分子机制提供参考。

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