猪札幌病毒的研究进展

李晶娇，沈权，李饴，华修国

1.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2.江苏大学医学院，镇江 212013



·特约专稿·

猪札幌病毒的研究进展

李晶娇1，沈权2，李饴1，华修国1

1.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2.江苏大学医学院，镇江 212013

摘要：猪札幌病毒(porcine sapovirus，PoSaV)是一种经粪-口途径传播引起猪急性胃肠炎的肠道病毒，对环境友好生态型养殖业构成一定威胁。研究表明，某些PoSaV与人SaV核苷酸序列具有很高的同源性，且越来越多来源于人和猪的SaV重组新毒株被发现，提示PoSaV具有跨种间感染及传播给人的潜在风险。迄今，PoSaV的入侵与感染、变异与迁移、免疫与致病、暴发与流行、跨种间感染与传播等机制尚不清楚。本文主要对PoSaV形态与抵抗力、基因组结构与功能、基因重组、传播方式、流行病学、受体等方面的研究进展进行综述。

关键词：猪札幌病毒；跨种间感染；基因重组；受体

札幌病毒(sapovirus，SaV)又称扎如病毒(sapporo-like virus)，为札幌病毒属，与诺如病毒属(Norovirus，NoV)、兔病毒属(Lagovirus)和囊病毒属(Vesivirus)同属杯状病毒科(Caliciviridae)，是导致人以及猪、狗、水貂等多种易感动物罹患急性胃肠炎的重要非细菌性病原之一。该病毒原型株于1977年在日本札幌市一所婴儿室暴发的急性胃肠炎患者中被发现[1]，主要经粪-口途径传播，对人兽健康构成一定威胁。有研究显示，某些猪札幌病毒(porcine sapovirus，PoSaV)与人SaV核苷酸序列具有很高的同源性，且越来越多的重组毒株被发现，提示PoSaV具有传播给人的潜在风险[2-6]。PoSaV的跨种间感染与传播的潜在可能性及其引起的相关公共卫生学问题已引起国内外学者的广泛关注。

PoSaV原型株最初在美国一只哺乳猪中被检出，并被定义为猪肠道杯状病毒(porcine enteric calicivirus，PEC)[7]，呈全球性分布，在亚洲、欧洲、北美等国家和地区均有发现。

1PoSaV的形态与抵抗力

PoSaV颗粒较小，直径23～32 nm，无包膜，衣壳呈二十面体对称，大部分蛋白折叠形成二聚体，每个二聚体形成一个拱形衣壳体，每个五维和三维轴处形成杯状凹陷[8]。有研究显示，NoV能耐受60 ℃的环境，在3.75 mg/L游离Cl-环境中处理30 min仍有感染力[9-10]，而关于SaV至今尚无相关研究。同为杯状病毒科的SaV是否具有与NoV类似的抵抗性，有待进一步证实。

2PoSaV的基因组结构

PoSaV基因组为单股正链RNA，全长7～8 kb。基于病毒衣壳蛋白核苷酸序列，SaV常划分为5个基因群(genogroup)：GⅠ～GⅤ，其中GⅠ、GⅡ、GⅣ和GⅤ型感染人，而GⅢ型主要感染猪。GⅠ、GⅣ和GⅤ型含有3个开放读码框架(open reading frame，ORF)，而GⅡ和GⅢ型只有2个ORF[11]。ORF1编码非结构蛋白和主要衣壳蛋白VP1；ORF2编码一个小的结构蛋白VP2；ORF3只存在于GⅠ、GⅣ和GⅤ型中，编码一个小的碱性蛋白，其功能尚不清楚，推测可能与病毒复制有关[12]。SaV的基因结构与兔出血热病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)的基因结构非常相似，ORF1编码的多聚蛋白表现为边翻译边被病毒蛋白酶裂解，产生6种非结构蛋白和VP1，从N端到C端依次为“NH2-p11-p28-p35(NTPase)-p32-p14(VPg)-p70〔Pro-Pol，具有3C样蛋白酶Pro和3D样RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)功能〕-p60(VP1)-COOH”(图1)。SaV的基因保守区位于ORF1上的RdRp区域，该区域也是基因重组的热点[11]。

图1SaV基因编码的蛋白

Fig.1The proteins of sapovirus

3PoSaV的基因重组

基因重组是病毒特别是RNA病毒进化的重要模式。SaV不仅在相同基因群内发生重组，还可在不同基因群间发生跨群重组(intergenogroup recombination)。2004年Katayama等首次报道了自然发生的GⅡ与GⅣ型之间的SaV重组毒株[13]，随后又发现了GⅢ型内的重组现象[13]。Hansman等也报道了PoSaV的基因群内重组现象，并发现一株与人源SaV毒株高度同源的PoSaV毒株[14]。提示这些重组毒株可能具备在人与猪之间跨种传播的能力，给SaV疫苗设计带来了新的挑战。

4PoSaV的检测方法

SaV检测主要基于病毒抗原、病毒RNA和血清抗体反应。电镜和抗原酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定分别针对完整的病毒和抗原；反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)和实时PCR针对病毒RNA；由于SaV病毒样颗粒(viral-like particle，VLP)具有与真病毒相似的形态和抗原性，而绝大多数SaV缺乏细胞培养体系，因此VLP常作为抗原广泛应用于ELISA检测血清抗体。

4.1电镜技术

人SaV原型毒株Sapporo和PoSaV原型毒株Cowden均通过电镜或免疫电镜发现。电镜检测灵敏度较低，对粪便中SaV的检测下限约为106病毒粒子/mL。而免疫电镜的灵敏度提高10倍以上，除观察形态外，还可观察抗原-抗体反应，但特异度取决于抗体的质量。

4.2RT-PCR

目前RT-PCR是检测SaV的首选方法。RT-PCR不仅特异度高，还可对病原的基因型和系统进化关系进行分析。Jiang等[15]基于RdRp基因设计了一对引物：p289/290，通过RT-PCR可获得319 bp NoV或331 bp SaV，广泛应用于人和多种动物粪便或组织中NoV和SaV的检测。在RT-PCR检测过程中，样品质量、RNA提取和纯化方法、引物设计、RT-PCR反应条件等多种因素均会影响检测结果。引物决定RT-PCR的特异性，尽管套式RT-PCR能将灵敏度提高10～1 000倍，但其易污染，故应用较少。

4.3免疫检测

免疫检测可用于病毒颗粒和可溶性抗原的检测。目前已建立了用于PoSaV Cowden毒株的免疫检测方法。通过从猪粪便样品中纯化的病毒和杆状病毒表达系统表达的VLP来免疫猪和豚鼠获得超免疫血清[16]，用于ELISA检测抗体[17-18]。Hansman等[6]以SaV VLP为抗原，采用ELISA检测患者粪便中的SaV，特异度达100%，但灵敏度只有RT-PCR的60%。

5PoSaV的传播途径

SaV的传染源包括患病的人或动物、隐性感染者及健康携带者，主要经粪-口途径传播，被患者粪便或呕吐物污染的水源、食物等都是主要传染源。人感染SaV为多发性，不仅可通过人与人直接接触或患者飞沫污染物体表面引发，还可通过食用受污染的食物尤其是生食贝类或未经煮熟的海螺引发[19]。而水貂感染SaV可能是由于喂食生的猪肝或肾所致[20]。与NoV相似，SaV感染多发生于冬季，但其他季节也有暴发。SaV在半封闭的环境或人口集中的地区较易暴发，如医疗单位、学校等场所，潜伏期为24～48 h，主要感染5岁以下儿童和老人[21]。临床症状主要为腹泻、呕吐、发热等。

6PoSaV的流行病学特征

SaV的宿主谱宽，常见宿主有人以及猪、牛、水貂等多种动物[22-23]。SaV既感染婴幼儿又感染成年人，经常在托儿所、护理中心、幼儿园、小学学校等人口密集场所暴发群体性感染，亦可导致散发病例，包括中国在内的很多国家都有散发病例或暴发流行。2011年Ozawa等首次报道在横滨神奈川餐馆食用GⅠ型SaV污染的生海螺引发的一起急性胃肠炎事件[19]。随后，SaV污染贝类等海产品的报道逐渐增多[14,24]。

猪是SaV的最主要动物宿主。PoSaV呈全球性分布，美国、日本、荷兰、加拿大、英国、意大利、韩国等国家均有报道，多表现为复杂的遗传多样性。PoSaV在各年龄段的猪体内均检测到[25]。有研究表明，哺乳期猪感染PoSaV后获得的免疫力可降低再次感染的概率[26]，这可解释成年猪感染率下降的现象。PoSaV的颗粒小、无包膜等形态学特征导致其在环境中的抵抗力较强，增加了无症状或亚临床症状猪体内该病毒的阳性率[27]。有研究显示，无症状猪与腹泻猪体内PoSaV阳性率几乎没有差别[28-29]。但大多数研究证实，PoSaV在腹泻中充当重要角色[30-31]，并可引起胃肠炎[29,32]。此外，PoSaV常与其他病毒如轮状病毒、嵴病毒等混合感染[33]。Martinez等对委内瑞拉7个猪场204份0～9周龄的仔猪粪便样品进行RT-PCR检测，发现PoSaV感染率达18%(36/204)[34]。Jeong 等对韩国6个地区78个猪场的粪便样品进行RT-PCR和套式RT-PCR检测，PoSaV阳性率达29.1%(69/237)[35]。2008年本课题组[36]首次在国内暴发腹泻的仔猪中检出PoSaV，并在华东地区规模化猪场进行PoSaV感染的流行病学调查时发现，1月龄以下的猪PoSaV感染率为1.79%(7/390)，明显高于1月龄以上的猪(1/515)[37]。黄泽彬等2009年对湖南地区多个猪场PoSaV感染进行流行病学调查，结果显示腹泻粪便样品中PoSaV阳性率高达12.7%(24/189)[38]。2014年Di Bartolo等报道了意大利PoSaV流行情况，无症状和腹泻猪粪便样品中PoSaV阳性率分别为6.19%(13/210)、20.22%(18/89)[39]。2015年Valente等用RT-PCR对巴西169份哺乳期母猪、断奶期仔猪、成年猪粪便样品进行PoSaV检测，阳性率为23.7%(40/169)[40]。

PoSaV主要为GⅢ型。2015年Valente等首次报道猪GⅨ型的存在[40]。目前，PoSaV包括GⅢ、GⅥ、GⅦ和GⅧ型，最近又有疑似新的基因型GⅨ？和GⅩ？型的报道[2,28,30,32,41]。

7PoSaV的细胞培养

Cowden毒株是目前唯一可体外培养的PoSaV。在培养基中添加无菌猪肠道内容物或胆汁酸时，该病毒可在LLC-PK细胞中复制[42]。由于至今人源SaV缺乏适合的细胞培养体系，可培养的猫杯状病毒(feline calicivirus，FCV)[43]、鼠诺如病毒(murine norovirus，MNV)[41]、恒河猴杯状病毒〔又称杜兰病毒(Tulane virus，TV)〕[44]和PoSaV都可能是合适的替代者，对研究人SaV与宿主细胞之间的相互作用及致病机制有一定的指导意义。

8PoSaV的受体研究

SaV是引起幼儿和多种动物急性胃肠炎的重要病原体[13,45]，给人类健康和公共卫生带来很大的危害。SaV的受体研究对其感染的治疗和预防具有非常重要的意义。然而，至今人SaV没有合适的细胞培养体系，严重阻碍了其致病机制及免疫机制的研究。Cowden毒株分离自一只27 d龄腹泻小猪的粪便样品，并定义为GⅢ型。因其可在LLC-PK细胞中增殖，故广泛应用于SaV与宿主细胞之间相互作用机制及人类感染致病机制的研究[46]。

病毒感染机体的第一步是病毒与宿主细胞表面受体相互作用。已有研究证明，人源和猪源NoV、RHDV及杜兰病毒识别组织血型抗原(histo-blood group antigen，HBGA)，NoV与连接于神经节苷脂或蛋白质上的唾液酸结合，而FCV则以-连接于糖蛋白上的唾液酸为受体[47-49]，可见糖类在杯状病毒科的吸附过程中发挥重要作用。

HBGA广泛分布于红细胞，黏液上皮细胞，呼吸道、泌尿生殖道及消化道细胞表面[50]。为验证HGBA是否为PoSaV识别细胞的受体，研究者采集来源于猪、鼠、鸡及人的红细胞设计凝集实验，发现PoSaV Cowden毒株不与任何来源的红细胞发生凝集反应，亦不能与合成的HBGA结合；且80 mmol/L的-乙酰神经氨酸可完全阻断PoSaV Cowden毒株对LLC-PK细胞的结合与感染，160 mmol/L的-乙酰神经氨酸可完全阻断其与十二指肠、空肠、回肠上皮细胞的结合，而半乳糖或唾液乳糖对PoSaV与细胞的相互作用无影响[45]。唾液酸通过α2,3-、α2,6-及α2,8-三种方式连接于多糖。研究者首先用专一性切断唾液酸α2,3-连接的40 mU/mL肺炎链球菌唾液酸酶SS[50]处理LLC-PK细胞，发现结合率降至49%，感染率降至44%。研究者又分别采用朝鲜槐凝集素(Maackia lectin，MAL)、欧洲接骨木凝集素(Sambucus lectin，SNL)预处理LLC-PK细胞，它们分别特异性结合α2,3-连接唾液酸、α2,6-连接唾液酸[37]，发现均能一定程度阻碍PoSaV对细胞的结合与感染[45]；而400 mg/mL MAL和 400 mg/mL SNL的混合物对LLC-PK细胞进行预处理则完全阻断PoSaV的结合与感染[45]。用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶处理LLC-PK细胞，可明显阻止PoSaV Cowden毒株的结合与感染，表明PoSaV识别细胞表面的唾液酸是连接在糖蛋白上的[45]。为研究唾液酸与糖蛋白的连接方式是-连接还是-连接，研究者用苯甲基4--β--吡喃半乳糖基-β--吡喃葡萄糖苷(benzylGalNAc)、衣霉素分别预处理LLC-PK细胞，两者分别是-连接糖基化、-连接糖基化的阻断剂。结果发现经benzylGalNAc处理后，PoSaV与细胞的结合与感染几乎被完全阻断[45]。因此，PoSaV Cowden毒株通过细胞膜上的-连接糖蛋白上的α2,3-连接和α2,6-连接唾液酸对细胞进行结合和感染。

有些病毒可利用多个受体进入细胞。病毒与第一个受体的结合可丰富细胞表面的病毒，促进与第二受体的结合[51]。如轮状病毒利用唾液酸或HGBA[52]、整合素及热休克蛋白Hsc70[53]来完成复杂的侵入细胞过程；又如FCV在结合细胞过程中需利用唾液酸和紧密连接蛋白1(junctional adhesion molecule 1，JAM-1)[49,54-55]。因此，SaV是否存在潜在的共受体仍需进一步研究。

9结语

综上所述，目前SaV的研究主要集中在流行病学方面。尽管PoSaV结合与感染LLC-PK细胞的受体已有初步研究，但由于人源SaV至今没有适合的细胞培养体系等原因，人们对SaV的入侵与感染、变异与迁移、免疫与致病、跨种间感染与传播、暴发与流行等病原与宿主互作关系，以及SaV感染宿主的发生、发展和转归等规律的研究尚不深入。此外，作为导致人与多种动物急性胃肠炎的主要病原体，动物源与人源SaV表现为遗传上高度同源性。猪是SaV最主要的动物宿主，PoSaV常以亚临床或隐性感染形式存在于健康猪群[56]；此外，不断有来源于人和猪的SaV重组新毒株被发现，均暗示猪可能具备“储存和整合”SaV的功能[55]，具备潜在的跨种间感染及传播给人的威胁[2,25]，进而引发人兽共患病及相应的食品安全和公共卫生等问题，这需引起重视。

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Research progress on porcine sapovirus

LI Jingjiao1,SHEN Quan2,LI Yi1,HUA Xiuguo1

1.School of Agriculture and Biology,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China;2.School of Medicine,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China

Abstract:Porcine sapovirus(PoSaV),transmitted through fecal-oral pathway,is an enteric calicivirus causing acute gastroenteritis in pigs,and poses a serious threat to the environment-harmony ecotype of breeding industry.Porcine sapoviruses closely related to human strains have been detected in swine.As more and more porcine and human recombinant sapoviruses have been reported,the potential risk of cross-species infections and zoonotic generation is a practical concern.However,researches on invasion,infection,mutation,migration,immunization,outbreaks,epidemiology,cross-species infection and transmission of porcine sapovirus are rare.In this review,we focus on viral morphology and resistance,genomic structure and recombinant,transmission,epidemiology and cell receptor of porcine sapovirus.

Key words:Porcine sapovirus;Cross-species infection;Genetic recombination;Receptor

基金项目：国家自然科学基金(31270168、31402211)

通信作者：华修国

Corresponding author.HUA Xiuguo,E-mail:hxg@sjtu.edu.cn

(收稿日期：2016-04-03)