多基因启动子甲基化诊断乙型肝炎病毒相关肝癌的研究*

刘冬松，陈岳明，董学妍，张卫英，余道军

（1.浙江省金华市中医医院检验科，浙江金华321017；2.浙江省杭州市第一人民医院检验科，浙江杭州310006）



多基因启动子甲基化诊断乙型肝炎病毒相关肝癌的研究*

刘冬松1，陈岳明2，董学妍2，张卫英2，余道军2

（1.浙江省金华市中医医院检验科，浙江金华321017；2.浙江省杭州市第一人民医院检验科，浙江杭州310006）

摘要：目的探讨血清多基因启动子甲基化在乙型肝炎病毒（HBV）相关肝细胞癌（HCC）中的诊断价值。方法随机收集98例HCC、75例肝硬化（LC）、90例慢性乙型肝炎（CHB）患者以及80例健康者血清各2ml，以血清BVES、APC、RASSF1A、TIMP3、GSTP1和HOXA9基因作为候选靶标。采用磁珠法提取血清DNA，MethyLight法检测基因启动子甲基化。通过构建受试者工作特征曲线（ROC）评价各检测指标的诊断效能。结果血清各基因启动子甲基化在HCC患者检测阳性率分别为：RASSF1A（52.04％）、APC（36.73％）、BVES （29.59％）、HOXA9（20.41％）、GSTP1（17.35％）和TIMP3（11.22％），其中APC甲基化阳性完全与RASSF1A重叠。血清RASSF1A甲基化从慢性HBV感染患者中诊断HCC的效能最高［敏感性=0.520，特异性=0.915，曲线下面积（AUC）=0.718］，优于血清AFP（敏感性=0.480，特异性=0.739，AUC=0.609）；血清6个基因启动子甲基化联合使用的敏感性、特异性及诊断效能进一步提高，分别为0.806、0.855和0.845。结论血清BVES、APC、RASSF1A、TIMP3、GSTP1及HOXA9基因启动甲基化联合检测能显著提高高危人群中HCC的诊断能力。

关键词：启动子；甲基化；肝细胞癌

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常见的人类恶性肿瘤之一，世界范围内每年可导致约500 000人死亡［1］。在东亚地区，HCC的主要病因是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染［2］。当诊断明确时，HCC患者往往已处于癌症进展期或发生远处转移，已错失有效的治疗时机。目前用于HCC诊断的常用标志物是血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP），因其敏感性和特异性较低，不能作为一个良好的HCC诊断指标。因此，寻找一种有效的筛选HCC的新标志物是当务之急，尤其是针对HBV相关HCC患者。

基因启动子CpG岛甲基化代表一种重要的表观遗传学机制，往往涉及人类的致癌过程。研究资料显示，肝脏组织中一些传统的抑癌基因和调节基因启动子异常甲基化可以作为HCC生物标志物［3］。癌症患者血清DNA来源于凋亡细胞、坏死细胞或肿瘤细胞等，并携带各种DNA改变，包括DNA整合、突变以及甲基化等标志，并且发现血清DNA的改变和相应的肿瘤组织中的改变高度一致［4-5］。该研究结果表明，血清DNA中基因启动子甲基化有可能作为HCC的无创诊断指标。

本研究通过文献发掘纳入6个常参与消化道致癌的基因（BVES、APC、RASSF1A、TIMP3、GSTP1和HOXA9）作为候选靶标。通过MethyLight方法来测定其在HCC、慢性乙肝后肝硬化（cirrhosis of liver，LC）、慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B，CHB）及健康人群中的甲基化状态，寻找能从CHB和LC患者中有效筛选HCC的指标。

1　资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年1月-2014年12月在金华市中医医院就诊的患者263例，包括98例HCC（HCC组），75例LC（LC组）及90例CHB患者（CHB组）。HCC诊断依据B超、计算机断层扫描（computed tomography，CT）及血清AFP检查结果，并最终由组织学确诊。LC诊断依据B超、CT检查患者伴有门脉高压和脾大；CHB诊断依据《慢性乙型肝炎防治指南》（2010版）［6］。所有患者血清HBV表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性，排除其他类型的肝脏疾病（自身免疫性肝炎、酒精性肝病、Wilson病和其他类型的病毒性肝炎等）及其他重大疾病。80例健康者（对照组）来自杭州市第一人民医院体检中心。各组年龄和性别配对。所有研究对象签署经杭州市第一人民医院伦理委员会批准的知情同意书。

1.2 血清DNA提取及亚硫酸盐处理

抽取患者接受治疗前及健康体检者空腹静脉血5 ml，置含促凝剂的真空采血管内，室温条件下2 000 g离心10 min，小心吸取2 ml血清至Eppendorf管内，12 000 g离心5min，吸取血清至新的Eppendorf管内，置入-80℃冰箱冷冻保存备用。血清DNA分离和纯化采用磁珠法试剂盒（北京金麦格公司）。采用EpiTect Bisulfite试剂盒（德国Qiagen Hilden公司）对提取的DNA进行亚硫酸钠处理并纯化，最终获得20μl处理后DNA置于-80℃冰箱冷冻保存备用。上述操作均按试剂盒说明书进行。

1.3 阳性对照品制备

取1μg从正常胎儿脐带血中提取的DNA，加入10 u SssⅠ甲基化转移酶（美国NEB公司），160μmol/L SAM和缓冲液于20μl体系中反应37℃、15 min，65℃、10 min，再按照DNA亚硫酸盐修饰的方法加以处理和纯化，产物置入-80℃冰箱冷冻保存备用。

1.4 MethyLight方法检测基因启动子甲基化

MethyLight方法是一种建立在TaqMan探针法实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，RT-PCR）上的甲基化定量分析技术，通过一对甲基化特异性扩增引物和一条覆盖若干CpG二核苷酸的水解探针，来对目的基因进行甲基化状态分析［7］。本实验以ACTB为内参基因，来校正样品间在模板量上的差异。引物和探针由上海辉睿生物科技有限公司合成（见表1）。反应体系包括2×PCR Buffer 10μl、200μmol/L dNTPs、0.3μmol/L正反向引物、0.1μmol/L探针、3.5 mmol/L MgCl2、0.5 u Taq酶、修饰后DNA 1.0μl，加水至20μl（PCR试剂购自日本Toyobo公司）。使用ABI PrismⓇ 7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）在96孔板上进行扩增，反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性15 s，58℃退火1 min，共45个循环。各基因启动子甲基化程度用甲基化比值（percentage of methylated reference，PMR）表示，PMR的计算参照参考文献［7］，以PMR＞4为阳性。

表1　MethyLight方法检测引物及探针序列

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验。多组间比较用单因素方差分析（One-way，ANOVA），两两比较用t检验，计数资料以百分比或率表示，用χ2检验，诊断效能用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线下面积（area under the curve，AUC）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 临床资料

共纳入343例研究对象的临床资料。4组患者的血清谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）、血清白蛋白（serum albumin，ALB）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、血小板计数（Platelets，PLT）、AFP水平比较，经ANOVA检验，差异有统计学意义（F=34.571、5.068、62.327、4.617和233.482；P=0.000、0.028、0.000、0.003和0.000）。其中HCC、LC及CHB组患者的ALT、TBIL、AFP水平与对照组比较，经t检验，差异有统计学意义（ALT：t=29.645、42.095和30.105，P=0.000；TBIL：t=52.502、70.328和34.206，P=0.000；AFP：t=254.778、111.592和98.263，P=0.000），HCC、LC及CHB组患者的ALT、TBIL、AFP水平均高于对照组；HCC、LC及CHB组患者的ALB、PLT水平与对照组比较，经t检验，差异有统计学意义（ALB：t=7.542、6.523和4.271，P=0.007、0.012和0.041；PLT：t=4.963、21.355和4.337，P=0.027、0.000和0.039），HCC、LC及CHB组患者的ALB、PLT水平低于对照组。

2.2 血清各基因启动子甲基化阳性率

HCC、LC、CHB组及对照组BVES、APC、RASSF1A、TIMP3、GSTP1和HOXA9基因启动子甲基化血清检测阳性率见表2。HCC组患者甲基化阳性率从高到低分别为：RASSF1A（52.04％）、APC （36.73％）、BVES（29.59％）、HOXA9（20.41％）、GSTP1（17.35％）和TIMP3（11.22％），其中APC甲基化阳性完全与RASSF1A重叠。RASSF1A基因启动子甲基化在LC患者血清中经常被检出（13.33％），甚至在健康人群中还有低比率阳性（3.75％）。其余5个基因在LC患者中呈现低比率阳性（2.67％～5.33％），而在健康人群中未检出。见表2。

表2　血清各基因启动子甲基化阳性率的分布　例（％）

2.3 血清各基因启动子甲基化对HCC的诊断效能

血清RASSF1A甲基化从慢性HBV感染患者中鉴别HCC的敏感性为0.520，高于其余6个诊断指标；BVES、APC、TIMP3、GSTP1及HOXA9甲基化的敏感性均不及AFP（≥20 ng/L），而血清各基因甲基化指标特异性均优于AFP（≥20 ng/L）；从慢性HBV感染患者中诊断HCC的效能排在前3位的指标分别是血清RASSF1A甲基化（AUC=0.718）、血清APC甲基化（AUC=0.650）及AFP（≥20ng/L）（AUC=0.609）。见表3。

表3　血清各基因启动子甲基化对HCC的诊断效能

2.4 血清基因启动子甲基化联合使用对HCC的诊断效能

从慢性HBV感染者中（CHB+LC）鉴别HCC，血清RASSF1A、BVES、APC、TIMP3、GSTP1和HOXA9基因启动子甲基化联合使用的敏感性、特异性及AUC分别为0.806，0.855和0.845；血清各基因启动子甲基化联合AFP（≥20 ng/L）的敏感性提高至0.878，特异性降至0.763，AUC为0.852，见附图。

A：RASSF1A+APC+BVES+TIMP3+GSTP1+HOXA9联合使用的ROC曲线（HCC vs CHB+LC）；B：RASSF1A+APC+BVES+TIMP3+GSTP1+ HOXA9+AFP联合使用的ROC曲线（HCC vs CHB+LC）附图　血清各基因启动子甲基化联合使用对HCC的诊断效能

3　讨论

在HBV高流行区域，基本形成从慢性肝炎到LC，甚至最终至HCC的肝脏疾病谱，且大多数HCC的发生伴随在LC的基础上［8］。因此，对慢性HBV感染人群进行定期、规律的HCC筛查，有助于HCC的及时诊治，提高患者生存期。

本研究选取常参与消化道肿瘤，特别是HCC发生的6个肿瘤相关基因（BVES，APC，RASSF1A，TIMP3，GSTP1及HOXA9）［9-12］。该基因涉及多种细胞功能或信号系统，如细胞黏附、侵袭、转移（BVES、APC和RASSF1A）、凋亡、血管生成（TIMP3），解毒（GSTP1）以及细胞分化（HOXA9）。经MethyLight法检测，HCC患者血清RASSF1A甲基化阳性率最高，为52.04％（51/98），其次是APC为36.73％（36/98），而且APC阳性完全与RASSF1A阳性重叠。值得注意的是，两者在LC及CHB均有低比率阳性；该结果表明，RASSF1A、APC甲基化可能是HCC发生、发展过程中较为普遍的一种表观遗传学改变，并且可能还是一个早期事件。

通过各指标从慢性HBV感染患者中鉴别HCC的敏感性和特异性分析，6个肿瘤相关基因中只有RASSF1A甲基化的敏感性高于AFP（0.520 vs 0.480），而特异性均高于AFP；从诊断效能看RASSF1A（AUC=0.718）、APC（AUC=0.650）和BVES （AUC=0.636）均好于AFP（AUC=0.609）。通过6个基因的联合使用，可明显提高HCC的诊断敏感性、特异性和效能，分别为0.806、0.855和0.845，如果再联合AFP，尽管诊断敏感性提高至0.878，但特异性明显降至0.763。

从本研究结果来看，血清BVES、APC、RASSF1A、TIMP3、GSTP1及HOXA9基因启动甲基化联合检测能明显提高本地区高危人群中HCC的诊断能力。

参考文献：

［1］FUNG S K，LOK A S. Management of patients with hepatitis B virus-induced cirrhosis［J］. J Hepatol，2005，42（l）: S54-S64.

［2］MASAHIRO T，FRANCISCO K，HIDEAKI K，et al. Hepatitis B and C virus infection and hepatocellular carcinoma in China: a review of epidemiology and control measures［J］. J Epidemiol，2011，21（6）: 401-416.

［3］NAGASHIO R，ARAL E，OJIMA H，et al. Carcinogenic risk estimation based on quantification of DNA methylation levels in liver tissue at the precancerous stage［J］. Int J Cancer，2011，129（5）: 1170-1179.

［4］JUNG K，FLEISCHHACKER M，RABIEN A. Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker: a critical appraisal of the literature［J］. Clin Chim Acta，2010，411（21/22）: 1611-1624.

［5］DULAIMI E，HILLINCK J，IBANEZ de CACERES I，et al. Tumor suppressor gene promoter hypermethylation in serum of breast cancer patients［J］. Clin Cancer Res，2004，10（18）: 6189-6193.

［6］中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）［J］.胃肠病学，2011，16（6）: 351-366.

［7］EADS C A，DANENBERG K D，KAWAKAMI K，et al. Methy-Light: a high-throughput assay to measure DNA methylation［J］. Nucleic Acids Res，2000，28（8）: e32.

［8］LU F M，LI T，LIU S，et al. Epidemiology and prevention of hepatitis B virus infection in China［J］. J Viral Hepat，2010，17（l）: 4-9.

［9］YU J，NI M，XU J，et al. Methylation profiling of twenty promoter-CpG islands of gene which may contribute to hepatocellular carcinogenesis［J］. BMC Cancer，2002，2: 29.

［10］MAH W C，LEE C G. DNA methylation: potential biomarker in hepatocellular carcinoma［J］. Biomarker Research，2014，2（1）: 5.

［11］SHIN S H，KIM B H，JANG J J，et al. Identifcation of novel methylation markers in hepatocellular carcinoma using a methylation Array［J］. J Korean Med Sci，2010，25（8）: 1152-1159.

［12］WILLIAMS C S，ZHANG B L，SMITH J J，et al. BVES regulates EMT in human corneal and colon cancer cells and is si lenced via promoter methylation in human colorectal carcinoma［J］. J Clin Invest，2011，121（10）: 4056-4069.

（申海菊编辑）

Promoter methylation of multiple genes for diagnosis of HBV-related hepatocellular carcinoma*

Dong-song Liu1，Yue-ming Chen2，Xue-yan Dong2，Wei-ying Zhang2，Dao-jun Yu2
（1. Department of Laboratory Medicine，Jinhua Traditional Chinese Medicine Hospital，Jinhua，Zhejiang 321017，China；2. Department of Laboratory Medicine，the First People's Hospital of Hangzhou，Hangzhou，Zhejiang 310006，China）

Abstract:Objective To evaluate the clinical values of promoter methylation of multiple genes in serum for diagnosis of HBV-related hepatocellular carcinoma（HCC）. Methods Two milliliters of sera were prepared from each participant including 98 HCC patients，75 liver cirrhosis（LC）patients，90 chronic hepatitis B （CHB）patients and 80 healthy controls. BVES，APC，RASSF1A，TIMP3，GSTP1 and HOXA9 were selected as candidate genes. Serum DNA was extracted with magnetic beads and modified by sodium bisulfite treatment. The methylation of the promoters of these genes was measured with MethyLight method. Receiver operating characteristic（ROC）curves were constructed and the areas under the ROC curves（AUCs）were calculated to determine the feasibility of using serum gene methylation as a biomarker for HCC. Results The positive rates of promoter methylation of the 6 genes in serum of the HCC patients were 52.04％for RASSF1A，36.73％for APC，29.59％for BVES，20.41％for HOXA9，17.35％for GSTP1 and 11.22％for TIMP3. The HCC patients with methylated APC had methylation of RASSF1A as well. The diagnostic performance of serum methylatedRASSF1A was superior to that of AFP and the other indicators for the discrimination of the patients with HCC from those with chronic HBV infection. Furthermore，the sensitivity，specificity and AUC of combination of promoter methylation of the 6 genes obviously increased. Conclusions Combined detection of serum BVES，APC，RASSF1A，TIMP3，GSTP1 and HOXA9 promoter methylation could improve the diagnosis of HCC in high-risk population.

Keywords:promoter；methylation；hepatocellular carcinoma

中图分类号：R735.7

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.11.009

文章编号：1005-8982（2016）011-0045-05

收稿日期：2016-01-11

*基金项目：浙江省杭州市医药卫生科技计划基金（No：2012Z004）

［通信作者］陈岳明，E-mail：hzsylab@163.com