大蒜素体外抗猴甲型轮状病毒的研究*

王佳美，王胜男，陈江曼，赵　微，李永刚

（辽宁医学院基础医学院，辽宁锦州121000）



大蒜素体外抗猴甲型轮状病毒的研究*

王佳美，王胜男，陈江曼，赵微，李永刚

（辽宁医学院基础医学院，辽宁锦州121000）

摘要：目的研究大蒜素体外抗猴甲型轮状病毒（SA11）的作用。方法通过病毒滴度测定来确定大蒜素能否抗SA11以及最佳浓度。结果大蒜素对MA104细胞的最大无毒浓度为100 mg/ml，病毒滴度测定可以得出，50 mg/ml的大蒜素可以抑制SA11感染的MA104细胞出现细胞病变效应（CPE）。结论一定浓度的大蒜素在体外有抗SA11的作用。

关键词：猴甲型轮状病毒；大蒜素；抗病毒；MA104细胞

轮状病毒（Rotavirus，RV）为双链RNA病毒，外观呈20面体结构，RV衣壳由3层同心包裹的结构蛋白构成，核心含1个由11条dsRNA构成的基因组，后者编码12种蛋白质，包括6种结构蛋白与6种非结构蛋白（nonstructural protein，NSP1-6）［1］。RV属于呼肠弧病毒属，是全世界范围内婴幼儿非细菌性腹泻的主要病因［2］。RV分为唾液酸非依赖及唾液酸依赖两大类，前者包含大部分人源RV，如Wa株，后者则包含很多动物来源的RV，如非洲绿猴轮状病毒株、猴甲型轮状病毒等［3］。大蒜素是大蒜的有效成分，对多种病毒和致病菌均有良好的抵抗和抑菌能力［4］。研究发现，大蒜素通过上调某些转录因子、如Tbet mRNA表达而促进辅助性T细胞（helper T cell，TH1）类细胞因子干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）分泌，诱导和促进TH1优势应答反应，增强机体特异性细胞免疫功能而发挥抗病毒作用［5-6］。现通过观察大蒜素体外对猴甲型轮状病毒11株（simian rotavirus A，SA11）的增殖抑制作用，希望为临床抗RV的治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1 实验试剂

大蒜素（北京索莱宝公司），达尔伯克必需基本培养基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），0.25％胰酶，青霉素，链霉素。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养MA104细胞生长液为DMEM培养基，加10％FBS，在37℃、5％二氧化碳CO2培养箱培养。

1.2.2 SA11的保存、复苏及培养MA104细胞（ATCC CRL-2378.1）广泛用于动物和人RV的适应性培养和特征鉴定。在较高的感染复数（multiplicity of infection，MOI）下（MOI≥2），感染后8～10 h可见细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。SA11由基础医学院病原生物学病原生物学实验室储存。病毒的复制方法：将MA104细胞以1.5×107铺于150cm2培养瓶中，用10 ml预热的DMEM培养基洗涤细胞。室温解冻SA11种子液，将相当于MOI≤0.1体积的种子液转移到一个离心管中，加入终浓度为20 mg/ml的胰酶活化病毒，瞬时涡轮混匀，将混合物置于37℃水浴箱中孵育1 h。活化后加入无血清DMEM培养基稀释混合物至胰酶浓度＜2μg/ml后，将混合物加入洗涤后的MA104细胞中，将培养瓶置于37℃孵育1 h后吸弃混合物，用预热的无血清DMEM培养基洗涤后加入无血清培养基至胰酶浓度为0.5μg/ml。细胞培养3～7 d，直至出现单层细胞完全裂解的CPE现象，将培养瓶中的细胞置入-80℃冰箱冷冻保存。将培养瓶中的感染细胞反复冻融3次，将细胞裂解物和培养基转移至离心管中1 000 r/min离心5 min，将上清液分装至1.5 ml离心管中。

1.2.3 病毒滴度测定将生长状况良好的MA104细胞用细胞生长液制成浓度为1×106个/ml细胞悬液，每孔接种100μl接种96孔板，放入37℃、5％CO2孵箱培养过夜。将SA11以20 mg/ml的胰酶37℃孵育1 h。采用半对数稀释法稀释病毒液：第1列加入146μl 1∶10稀释过的病毒液，其他各列每孔加入100μl DMEM培养基。然后用多道加样器从第1孔吸46μl至第2孔，做系列半对数稀释，使之成为1×10-1、1×10-1.5、1×10-2至1×10-6，每孔含有100μl病毒液。将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中进行病毒吸附1 h后，吸出病毒液，每孔加入100μl含有终浓度8μg/ml胰酶的病毒维持培养液，另设一列阴性对照孔，37℃、5％CO2培养箱培养。72 h以后用甲醛固定，亚甲基蓝染色后观察记录细胞CPE情况，并计算出组织细胞半数感染量（tissue culture infective dose，TCID50）。

1.2.4 不同浓度大蒜素对MA104细胞CPE形成的影响将MA104细胞以1×106个/孔接种在6孔板内。用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤细胞。加入以20mg/ml的胰酶37℃孵育1h后的SA11至MOI值为3，吸附1 h后，吸出病毒液。加入含有终浓度8μg/ml胰酶的病毒维持培养液，6孔板中分别加入终浓度为20、30、40和50 mg/ml大蒜素，同时设置未加病毒和大蒜素的阴性对照组和只加病毒而不加大蒜素的阳性对照组。继续将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养。病毒感染后观察8、24、48和72 h时的细胞病变情况，并收取各时间点的病毒上清液进行TCID50的测定。

1.2.5 大蒜素对不同MOI值的SA11的影响根据不同浓度大蒜素对SA11的抑制结果，选取最佳浓度的大蒜素，加入不同MOI值SA11感染的MA104细胞。感染后观察8、24、48和72 h时的细胞病变情况，并收取各时间点的病毒上清液进行TCID50的测定。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，进行重复测量设计的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 大蒜素对MA104细胞的毒性试验

72 h后通过观察CPE现象，确定大蒜素对MA104细胞的最大无毒浓度为100 mg/ml。

2.2 病毒滴度测定

选取SA11感染的MA104细胞，用Karber公式计算TCID50。LogTCID50=L-d（s-0.5）。L为病毒滴定时所用的最低稀释度；d为每log稀释度的间距；s为被感染细胞的比例之和。

根据表1中的结果，代入公式计算得出SA11感染MA104细胞后的TCID50，logTCID50=-1-0.5× （4.625-0.500）=-3.0625。取对数后得出logTCID50=1×10-3.0625，TCID50=1×103.0625，结果表示，该病毒经稀释至1/103.0625时，每孔细胞接种0.1 ml，可使50％的细胞出现CPE现象。病毒的效价通常以每ml含有多少TCID50表示。则上述病毒的效价T=1× 103.0625TCID50/0.1 ml=1×104TCID50/ml。

表1　SA11感染MA104细胞后的TCID50值

2.3 不同浓度大蒜素对MA104细胞CPE形成的影响

SA11至MOI值为3时，8 h时各组细胞CPE现象不明显，24 h时阳性对照组感染孔已出现明显的CPE现象，添加不同浓度大蒜素的病毒感染孔的CPE现象与单独病毒感染孔相比较少。48～72 h时添加不同浓度大蒜素的病毒感染孔出现CPE现象，其中大蒜素终浓度为50 mg/ml的病毒感染孔出现CPE现象较少，说明可以抑制SA11感染的MA104细胞出现CPE现象的最适大蒜素浓度为50 mg/ml。

病毒感染后收取8、24、48和72 h的病毒上清液进行TCID50的测定。SA11至MOI值为3时，8 h 时20、30、40和50 mg/ml组与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.000），30、40和50mg/ml组与20mg/ml组比较，差异有统计学意义（P=0.000）；24～72 h时添加各浓度大蒜素对比单独病毒感染孔TCID50，差异有统计学意义，添加不同浓度大蒜素的病毒感染孔的病毒滴度低于单独病毒感染孔，其中大蒜素终浓度为50 mg/ml的病毒感染孔TCID50值低于添加其他浓度大蒜素组，与之前CPE现象基本相同。见图1和表2。

图1　不同浓度大蒜素对MA104细胞CPE形成的影响

表2　不同时间点不同浓度大蒜素感染MA104细胞后的TCID50比较（±s）

表2　不同时间点不同浓度大蒜素感染MA104细胞后的TCID50比较（±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与20 mg/ml组比较，P＜0.05；3）与30 mg/ml组比较，P＜0.05；4）与40 mg/ml组比较，P＜0.05

组别　8 h　24 h　48 h　72 h　F时间值F组间值P时间值P组间值对照组　1.54±0.04　2.65±0.05　2.81±0.02　4.14±0.04 20 mg/ml组　1.37±0.031）2.57±0.03　2.7±0.011）3.76±0.091）30 mg/ml组　1.3±0.011）2）2.25±0.061）2）2.31±0.021）2）3.52±0.031）2）4 776.766 1 417.603　 0.000　 0.000 40 mg/ml组　1.27±0.031）2）2.15±0.031）2）3）2.18±0.021）2）3）3.38±0.11）2）3）50 mg/ml组　1.25±0.051）2）1.74±0.081）2）3）4）1.99±0.051）2）3）4）3.05±0.011）2）3）4）

2.4 大蒜素对不同MOI值的SA11的影响

根据不同浓度大蒜素对SA11的抑制结果，选取最佳浓度的大蒜素，即50 mg/ml，加入MOI值为1、2、3和5的SA11感染的MA104细胞，8 h时MOI值为1、2、3和5的SA11病毒感染的MA104细胞CPE现象不明显（见图2），24 h开始CPE现象逐渐明显（见图3），且随着MOI值的加大，CPE现象增强（见图4、5），说明随着病毒量的加大，大蒜素的抑制作用减弱。

图2 8 h时大蒜素对不同MOI值的SA11的影响

图3　24 h时大蒜素对不同MOI值的SA11的影响

图4　48 h时大蒜素对不同MOI值的SA11的影响

图5　72 h时大蒜素对不同MOI值的SA11的影响

如图6所示，病毒感染后收取8、24、48和72h的病毒上清液进行病毒TCID50的测定。24、48和72 h时添加大蒜组（+）与未添加大蒜素组（-）不同MOI值的TCID50比较，差异有统计学意义（P＜0.01），8 h添加大蒜素组与未添加大蒜素组MOI值的TCID50比较，差异无统计学意义（见表3～6），与之前CPE的测定结果基本相同。见图6。

表3　MOI=1时各时间点的比较（±s）

表3　MOI=1时各时间点的比较（±s）

注：1）与8 h比较，P＜0.05；2）与24 h比较，P＜0.05；3）与48 h比较，P＜0.05

组别　8 h　24 h　48 h　72 h　F时间值　F组间值　P时间值　P组间值MOI=1（+）　1.13±0.03　 1.33±0.031）1.63±0.031）2）2.38±0.031）2）3）1 662.247　 217.598　 0.000　 0.000 MOI=1（-）　1.12±0.01　 1.5±0.041）2.13±0.061）2）2.4±0.031）2）3）

表4　MOI=2时各时间点的比较（±s）

表4　MOI=2时各时间点的比较（±s）

注：1）与8 h比较，P＜0.05；2）与24 h比较，P＜0.05；3）与48 h比较，P＜0.05

组别　8 h　24 h　48 h　72 h　F时间值　F组间值　P时间值　P组间值MOI=2（+）　1.18±0.03　 1.5±0.011）1.83±0.111）2）2.6±0.031）2）3）802.509　 93.684　 0.000　 0.001 MOI=2（-）　1.12±0.01　 1.81±0.061）2.35±0.051）2）2.79±0.091）2）3）

表5　MOI=3时各时间点的比较（±s）

表5　MOI=3时各时间点的比较（±s）

注：1）与8 h比较，P＜0.05；2）与24 h比较，P＜0.05；3）与48 h比较，P＜0.05

组别　8 h　24 h　48 h　72 h　F时间值　F组间值　P时间值　P组间值MOI=3（+）　1.25±0.05　 1.74±0.081）1.99±0.051）2）3.05±0.011）2）3）1 892.854　 5 174.738　 0.000　 0.000 MOI=3（-）　1.24±0.04　 2.65±0.051）2.81±0.021）2）4.14±0.041）2）3）

表6　MOI=5时各时间点的比较（±s）

表6　MOI=5时各时间点的比较（±s）

注：1）与8 h比较，P＜0.05；2）与24 h比较，P＜0.05；3）与48 h比较，P＜0.05

组别　8 h　24 h　48 h　72 h　F时间值　F组间值　P时间值　P组间值MOI=5（+）　1.35±0.04　 1.89±0.021）2.56±0.071）2）4.01±0.051）2）3）1 348.661　 19 451.36　 0.000　 0.000 MOI=5（-）　2.52±0.07　 2.95±0.11）3.67±0.081）2）4.97±0.071）2）3）

图6　大蒜素对不同MOI值的SA11的影响

3　讨论

轮状病毒是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科。轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一，其主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻［7］。它是婴儿与幼儿腹泻的单一主因。然而，每一次感染后人体免疫力会逐渐增强，后续感染的影响就会减轻，因而成人很少受其影响［8］。轮状病毒总共有7个种，以英文字母编号为A、B、C、D、E、F和G。其中，A种是最为常见的一种，人类超过90％的轮状病毒感染案例也都是由A种造成的［9］。大蒜是药食同源，作为民间药物历史悠久，近年来大蒜素试剂不断研制和开发。大蒜素作为其有效成分之一，具有抗菌、抗炎、抗病毒、免疫调节等多方面的作用。临床上有很多报道大蒜素注射液对轮状病毒腹泻患儿有较好的退热和止泻作用［10］，可能与其提高患者免疫力或清除自由基功能有关，其抗病毒机制有待进一步研究，本实验观察大蒜素体外对SA11的感染是否有抑制作用，为确保细胞的安全性，避免在实验过程中发生细胞死亡现象，实验前先进行大蒜素的细胞毒性实验，确定大蒜素对MA104细胞的最大无毒浓度为100 mg/ml。

病毒感染细胞是个动态的过程，感染的效果随病毒量及感染时间改变而差异显著。确定一个合适的感染状态，是研究病毒宿主相互作用的一个重要前提，既要保证足够的感染效率，又要有合适的病理改变。实验提示随着病毒MOI值的加大，感染细胞凋亡及坏死情况逐渐严重；从感染时间上看，感染8 h后细胞坏死不明显，随着感染时间延长，感染细胞凋亡及坏死情况逐渐严重。而病毒感染量及感染时间的确定，为下一步对大蒜素体外抗轮状病毒感染和拓宽大蒜素的临床应用提供部分理论依据。

参考文献：

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（申海菊编辑）

Effect of garlicin on Simian rotavirus A in vitro*

Jia-mei Wang，sheng-nan Wang，Jiang-man Chen，Wei Zhao，Yong-gang Li
（Basic Medical College，Liaoning Medical University，Jinzhou，Liaoning 121000，China）

Abstract:Objective To investigate the effect of garlicin on Simian rotavirus A（SA11）in vitro. Methods Various concentrations of garlicin were used to inhibit SA11 replication so as to find out the best concentration for the inhibition. Results The maximal nontoxic concentration of garlicin for MA104 cells was 100 mg/ml. Tissue culture revealed that 50 mg/ml garlicin could inhibit the cytopathic effect of MA104 cells infected by SA11. Conclusions Garlicin could produce obvious inhibitory effects on Simian rotavirus A in vitro.

Keywords:Simian rotavirus A；garlicin；antivirus；MA104 cell

中图分类号：R373

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.11.001

文章编号：1005-8982（2016）011-0001-06

收稿日期：2015-11-10

*基金项目：国家自然基金青年基金（No：81201285）；辽宁省博士启动基金（No：20141134）；辽宁医学院领军人物创新团队（No：173615007）

［通信作者］李永刚，E-mail：lygjo@hotmail.com；Tel：0416-4673418