丹参素对HK-2细胞转分化和凋亡的调控

刘思聪，魏金枫，彭勇硕，王　雪，曲　琦，包新宇，张海涛，栾海艳

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江省 佳木斯 154007)

丹参素对HK-2细胞转分化和凋亡的调控

刘思聪，魏金枫，彭勇硕，王雪，曲琦，包新宇，张海涛，栾海艳

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江省 佳木斯 154007)

摘要：本文旨在研究丹参素对HK-2细胞转分化和凋亡的调控及其机制。方法：贴壁培养HK-2细胞于含10%FBS的DMEM培养基中，并将细胞分为N组，H组和D组。N组被培养于含5.5 mmol/L低糖的DMEM培养基中，H组被培养于含25 mmol/L高糖的DMEM培养基中，D组则被培养于含25 mmol/L高糖和0.2 mg/ml丹参素的DMEM培养基中，作用时间为48 h。实验结束后，倒置显微镜下观察HK-2细胞形态；免疫组织荧光技术检测CollagenⅠ、E-cadherin、FN的表达。结果：1.形态变化：N组细胞呈固有的多边形，胞核也呈固有的椭圆形；而H组绝大多数细胞已失去固有的形态，呈现纤维化改变，且胞核也呈梭形变；但D组大部分细胞仍保持原有的上皮细胞形态，仅少量呈现纤维化改变。2. CollagenⅠ、E-cadherin和FN蛋白的表达：对照N组，H组的CollagenⅠ、E-cadherin和FN蛋白表达明显升高(P<0.05)；而对照H组，D组CollagenⅠ、E-cadherin和FN的蛋白表达则明显下降(P<0.05)，但对照N组，其仍未达到正常表达水平(P<0.05)。结论：丹参素能通过降低CollagenⅠ、E-cadherin和FN的表达来减弱高糖对HK-2 细胞的转分化和凋亡作用。

关键词：丹参素；HK-2细胞；转分化与凋亡

0引言

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是导致终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)的主要原因，也是一类以进行性肾纤维化为特征的疾病，[1]其肾脏功能的下降与肾间质纤维化和肾小球硬化的关系十分密切。研究表明，无论从发病时间或机制来说，肾小管结构或功能的改变对DN的发生发展均具有重要的影响。因此，本研究拟采用高糖诱导的方法，使HK-2细胞发生转分化和凋亡，同時给予丹参素(danshensu, DSS)作为药物干预，观察其对HK-2细胞转分化和凋亡的影响，以期为临床治疗糖尿病肾纤维化为特征的疾病提供一个新的治疗方案。

1材料与方法

1.1实验对象及分组

在37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内，用含10% 胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)的DMEM培养基贴壁培养HK-2细胞，待其处于对数生长期后用于后续实验。

实验细胞分三组：正常组(N组)；高糖组(H组)；丹参素组(D组)。

1.2给药方案

N组用含5.5 mmol/L低糖的DMEM培养基培养，H组用含25 mmol/L高糖的DMEM培养基培养，而D组则用含25 mmol/L高糖和0.2 mg/ml丹参素的DMEM培养基培养，作用时间为48 h。

1.3检测指标

采用倒置显微镜观察HK-2细胞的形态改变；免疫组织荧光技术检测CollagenⅠ、E-cadherin、FN蛋白表达的改变。

1.4检测试剂

丹参素(药物纯度：98.0%，南京泽朗医药科技有限公司)；胎牛血清(GIBCO, USA)；DMEM培养基(Hyclone, USA)；CollagenⅠ、E-cadherin和FN(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.5统计学分析

2结果

2.1HK-2细胞的形态变化

N组细胞呈现固有的多边形，胞核也呈现固有的椭圆形；而H组绝大多数细胞已失去其固有的形态，呈现纤维化改变——成纤维细胞样的长梭形，且胞核也呈梭形变；但D组大部分细胞仍保持原有的上皮细胞形态，仅少量呈现纤维化改变。

2.2CollagenⅠ、E-cadherin和FN的蛋白表达

对照N组，H组的CollagenⅠ、E-cadherin和FN蛋白表达明显升高(P<0.05)；而对照H组，D组CollagenⅠ、E-cadherin和FN的蛋白表达则明显下降(P<0.05)，但对照N组，其仍未达到正常表达水平(P<0.05)。(见图1)

图1　CollagenⅠ、E-cadherin和FN蛋白在HK-2细胞中的表达情况*N组vs H组，P <0.05；# H组vs D组，P <0.05。

3讨论

肾小管间质病变的严重程度与DN的肾功能损害密切相关，[2]是反映肾功能下降程度和判断预后的最重要指标。肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis, TIF)的发病机制主要是细胞外基质(extracelluar matrix, ECM)的过量分泌、异常沉积，成纤维细胞(Myofibroblast, MyoF)的增生，以及肾小管的萎缩和消失。[3]

肾间质中ECM过度沉积是肾小管间质纤维化的基本病理特征，包括胶原(I、Ⅲ、IV、Ⅴ、VII型)，纤维连接蛋白(fibronectin, FN)和层粘连蛋白(laminin)。研究表明，在一些病理条件下，肾小管上皮细胞(Tubular Epithelial Cell, TEC)可发生上皮细胞向肌成纤维细胞的转分化(Tubular epithelial myofibroblast transdifferentiation, TEMT)，即肾小管上皮细胞丧失其原有的上皮细胞表型特征，而获得肌成纤维细胞的表型，并大量表达其标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)。TEMT能直接参与肾间质纤维化的进程，是DN肾间质纤维化发生发展的中心环节，[4]且已成为肾纤维化乃至慢性肾功能衰竭的重要机制之一。研究发现，DN患者肾组织中TEMT的多少与间质纤维化的程度显著关联，与尿蛋白数量、肾功能下降程度也紧密关联。通常认为肾间质纤维化的主要特征是出现MyoF，MyoF是肾间质纤维化形成过程中产生ECM的主要效应细胞，是TEMT的关键步骤。[5]

此外，肾间质细胞和肾小管细胞过度的增殖与凋亡(apoptosis)也能够引起肾小管上皮细胞发生萎缩和肾间质纤维化，[3]可造成组织器官的结构和功能异常，甚至丧失，是肾脏重构的启动因素，[4]凋亡既是肾脏功能损伤的结果，更是肾脏损伤持续的原因。近年来，随着人们对细胞凋亡的信号转导、基因调控以及与疾病之间关系的深入研究，发现DN也与细胞凋亡的发生发展关系密切；[5]在DN大鼠的体内和高糖条件下培养的肾小管上皮细胞中都发现，发生凋亡的肾小管上皮细胞数目明显增多。[6]

丹参作为传统的中草药在治疗DN的研究中取得了重大突破，已广泛应用于临床。研究证实，丹参酮能够抑制肾间质纤维化来源的成纤维细胞体外增殖，[7]降低大鼠病侧肾间质 TGF-β1和α-SMA表达水平，减少炎性细胞浸润及IV型胶原沉积，减少ECM生成，促进ECM降解保护肾小管的正常结构，延缓肾间质纤维化的发生。[8]丹参素对肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)的生长增殖具有明显抑制作用，能上调Smad7 mRNA的表达，下调Smad2、Smad3 mRNA的表达，降低α-SMA的表达，抑制HSCs活化。[9]丹参素还能负性调控肝纤维化过程，对TGF-β1引起的HSCs增殖具有明显抑制作用，拮抗TGF-β引起的BMP受体表达下调，进而影响下游Smad分子。[10]此外，丹参素对TGF-β1/Smad/ERK信号通路也具有抑制效应。[11]本实验着重选取了丹参的主要水溶性成分之一——丹参素作为我们的研究目标，以期为丹参防治糖尿病肾病提供更有力的理论依据，并提高其利用效率，降低其副作用，更好地发挥祖国传统医学的作用。我们的研究显示，丹参素能抑制高糖对HK-2 细胞的转分化和凋亡，并且这种调节是通过降低CollagenⅠ、E-cadherin和FN的表达来实现的。

参考文献：

[1]Thorp ML. Diabetic nephropathy: common questions. Am Fam Physician. 2005 Jul 1;72(1):96-9.

[2]Liu Y. Renal fibrosis: new insights into the pathogenesis and therapeutics. Kidney Int. 2006 Jan;69(2):213-7.

[3]Hills CE, Squires PE. The role of TGF-β and epithelial-to mesenchymal transition in diabetic nephropathy. Cytokine Growth Factor Rev. 2011 Jun;22(3):131-9.

[4]Nangaku M. Mechanisms of tubulointerstitial injury in the kidney: final common pathways to end-stage renal failure. Intern Med. 2004 Jan;43(1):9-17.

[5]Massagué J. How cells read TGF-beta signals. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000 Dec;1(3):169-78.

[6]Kanwar YS, Wada J, Sun L, Xie P, Wallner EI, Chen S, Chugh S, Danesh FR. Diabetic nephropathy: mechanisms of renal disease progression. Exp Biol Med (Maywood). 2008 Jan;233(1):4-11.

[7]孙兴旺, 曹灵, 于国华, 等. 丹参酮-A磺酸钠对纤维化人肾间质成纤维细胞体外增殖及cyclin E蛋白表达的影响. 第三军医大学学报， 2007,29(7):585-7.

[8]唐锦辉, 占成业. 丹参酮Ⅱ-对大鼠肾间质纤维化的抑制作用. 内科急危重症杂志,2008,14(1):16-8.

[9]戴晴, 李欣, 郑磊, 董志. 丹参素对肝星状细胞TGF-β信号转导的影响. 中国病理生理杂志， 2009;25(10):1988-94.

[10]武鹏宇, 戴立里, 唐静, 呙琳琳. 丹参素对肝星状细胞增殖活化及TGF-β/BMP受体表达的影响. 重庆医科大学学报， 2010;35(9):1344-47.

[11]唐静, 戴立里, 呙琳琳, 武鹏宇. 肝纤维化中丹参素对TGF-β1/Smads/ERK信号通路的影响及其相互关系. 第三军医大学学报，2011;33(11):1159-64.

(编辑马海超)

The Regulation of Danshensu on the Transdifferentiation and Apoptosis of HK-2 Cells

LIU Sicong, WEI Jinfeng, PENG Yongshuo, WANG Xue, QU Qi, BAO Xinyu, ZHANG Haitao, LUAN Haiyan

(The Department of Basic Medical Sciences in Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Abstract：Observe the regulation and mechanism of DSS on transdifferentiation and apoptosis of HK-2 cells. Method: Culture HK-2 cells in DMEM medium which contains 10% FBS, and divide the cells into three groups: N, H and D. Group N was cultured in DMEM medium which contained 5.5 mmol/L glucose; group H was cultured in DMEM medium which contained 25 mmol/L glucose; group D was cultured in DMEM medium which contained 25 mmol/L glucose and 0.2 mg/ml DSS, acting for 48 h. After the experiment, observe the change of HK-2 cells morphology under the inverted microscope; and detect the expressions of CollagenⅠ、E-cadherin and FN by fluorescence immunohistochemistry. Results: 1. Morphology changes: the cells of group N were polygonal, and the nucleus were oval; most of cells in group H had lost their original forms, showing fibroblast-like fusiform, and the nucleus also changed into fusiform; most cells in group D still remained the original epithelial cell morphology, and only a small amount of cells changed into long fibroblast-like spindle. 2. The expression of CollagenⅠ、E-cadherin and FN: compared with group N, the expressions of CollagenⅠ, E-cadherin and FN in group H were increased significantly (P<0.05); compared with group H, they in group D were decreased significantly (P<0.05), but compared with group N, they had not yet reached normal level (P<0.05). Conclusion: DSS could weak the transdifferentiation and apoptosis of HK-2 cells which were induced by high glucose. And this effect was realized by decreasing the expressions of CollagenⅠ、E-cadherin and FN.

Keywords：Danshensu; HK-2 cells; transdifferentiation and apoptosis

收稿日期：2016-01-27

基金项目：2014年佳木斯大学大学生科技创新项目(XSYD2014-015)。

作者简介：刘思聪(1992—),在读学士。研究方向：糖尿病肾病的研究基金项目。 通讯作者：栾海艳(1979—),女，博士研究生，佳木斯大学基础医学院生理教研室，讲师，硕士研究生导师。研究方向：糖尿病肾病及其机制的研究。

中图分类号：R692.6

文献标识码：A文章编码：1672-0601(2016)05-0001-04