喹诺酮类药物在麻鸡体内的转化和分布规律

柳爱春，刘　超，赵　芸，陈效绘

(1.杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024； 2.杭州志绿生态农业开发有限公司，浙江 杭州 311121)

喹诺酮类药物在麻鸡体内的转化和分布规律

柳爱春1，刘超1，赵芸1，陈效绘2

(1.杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024； 2.杭州志绿生态农业开发有限公司，浙江 杭州 311121)

摘要：采用经免疫胶体金法快速检测鸡蛋中喹诺酮类(QNs)呈阴性的雪山麻鸡为试验材料，分别注射5 mg·kg-1环丙沙星、5 mg·kg-1恩诺沙星和10 mg·kg-1诺氟沙星，每天2次，连用2 d，在停药后48 h和第9天分批屠宰取样，并利用LC-MS/MS检测胸肌、肝脏、血液和卵泡中12种QNs的含量。结果表明：每种药物在麻鸡体内经转化后生成6种以上QNs；不同组织中QNs残留量差异较大，其中肌肉和血液中QNs代谢快、残留量低(休药9 d，残留量低于19 μg·kg-1)，肝脏和卵泡QNs残留量相对较高；环丙沙星和诺氟沙星及其转化产物均在肝脏富集，诺氟沙星在肝脏中代谢尤为缓慢(休药9 d，QNs残留量为1 773.7 μg·kg-1)；恩诺沙星在麻鸡体内快速转化成其他QNs，并在卵泡中高度富集，休药48 h在肝脏、血液和卵泡中转化率高达100%，卵泡中QNs残留量达8 327.3 μg·kg-1，因此，恩诺沙星在产蛋鸡上使用，可能在鸡蛋中会产生大量的QNs残留。

关键词：喹诺酮类；转化；麻鸡；LC-MS/MS；残留

喹诺酮类(quinoiones，QNs)是一类人畜通用的化学合成的广谱抗菌药，由于这类药物高效低毒、价格低廉，因此被广泛应用于畜禽养殖中预防、治疗疾病[1-3]。人食用有QNs残留的动物性农产品后，人体正常的肠道菌群被破坏，从而引起肠道功道紊乱，此类药物易引起肝损害和关节病变，影响儿童骨骼发育，还可诱发癫痫和神经症状；人类长期食用含较低浓度QNs药物的动物性食品，容易诱导细菌耐药性的传递[4]，甚至产生超级细菌[5]，从而影响该类药物的临床疗效。美国FDA于2005年宣布禁止用于治疗家禽细菌感染的抗菌药物恩诺沙星的销售和使用。中国农业部235号公告中规定了环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹7种QNs药物在动物组织和奶中的最高残留限量为10～500 μg·kg-1，但对鸡蛋仅规定噁喹酸残留限量50 μg·kg-1，对其他喹诺酮类残留量未有明确规定，喹诺酮类是医学临床抗感染至关重要的抗菌药物， 需严格监控其耐药性动态。杭州市农贸市场和超市销售的禽蛋采用免疫胶体金试剂盒检测，QNs阳性率为18.8%，经液相色谱—串联质谱法(LC-MS/MS)确证后发现，禽蛋中检出的QNs药物品种多达12种，其中10.9%的样品QNs残留量大于100 μg·kg-1，最高达2 137 μg·kg-1[6]。早在20世纪80年代就已经发现恩诺沙星在动物体内转化生成具有活性作用的环丙沙星[7]，国内关于不同动物体内恩诺沙星及其转化生成的环丙沙星的药代动力学研究已有不少报道[8-9]，但对环丙沙星、恩诺沙星和诺氟沙星在动物体内转化为其他喹诺酮类药物的研究却鲜有报道，尤其是喹诺酮类药物在卵泡中转化和残留规律的研究未见报道，因此，无法解释目前市售禽蛋中QNs残留量高且药残品种多的原因。为了探索喹诺酮类药物在畜禽体内的转化和分布规律及药物残留情况，本研究进行了恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星在雪山麻鸡体内的转化试验。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物

以谷物喂养的雪山麻鸡，由杭州志绿生态农业开发有限公司提供。

1.1.2药品与试剂

盐酸环丙沙星和盐酸恩诺沙星(含量98.9%)，由浙江国邦药业有限公开司提供；诺氟沙星(纯度>98.0%)，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。喹诺酮免疫胶体金试剂盒(检测限为20 μg·kg-1)，实验室自制；喹诺酮类药物标准物质：氟甲喹Flumequine(简写Flu)、诺氟沙星Norfloxacin(简写Nor)、依诺沙星Enoxacin(简写Eno)、环丙沙星Ciprofloxacin(简写Cip)、培氟沙星Pefloxacin(简写Pef)、洛美沙星Lomefloxacin(简写Lom)、达氟沙星Danofloxacin(简写Dan)、恩诺沙星Enrofloxacin(简写Enr)、氧氟沙星Ofloxacin(简写Ofl)、麻保沙星Marbofloxacin(简写Mar)、沙拉沙星Sarafloxacin(简写Sar)、二氟沙星Difloxacin(简写Dif)均为德国Dr公司生产的纯品型有证标准品，购自上海安谱实验科技股份有限公司；乙腈、甲醇、正己烷均为色谱纯。

1.1.3仪器与设备

Waters Xevo TQ-S液相色谱-串联质谱仪(美国)；METTLER电子天平(中国上海): 感量0.01和0.000 1 g；IKA磁力搅拌器和漩涡混匀器；KH3200DE超声波仪(中国昆山)；Eppendorf 5810台式离心机(德国)；N-EVAP氮吹仪(美国)； Thermo 10～100 μL，100～1000 μL，1～5 mL移液器。

1.2方法

1.2.1免疫胶体金法快速检测鸡蛋中喹诺酮类药物

从周边的养殖场采集鸡蛋样品，采用实验室自制的免疫胶体金试剂盒快速筛检：将鸡蛋黄和蛋清一起匀浆制成蛋液，用滴管吸取0.5 mL蛋液，加1 mL复溶剂中摇匀制成待检溶液；从铝箔袋中取出胶体金试剂板；用滴管吸取待检溶液垂直滴加4滴(约125 μL)于试剂板的加样孔中；加样后开始计时，在3～5 min内用肉眼观察结果，结果判定原则参照文献[10]，筛选出阴性鸡蛋，并进一步用LC-MS/MS法确证，选取鸡蛋中未检出喹诺酮类残留，并以谷物喂养的鸡群为试验动物。

1.2.2给药和采样

注射液配制：(1)10 mg·mL-1盐酸环丙沙星注射液，称取0.50 g盐酸环丙沙星于100 mL小烧杯中，加少量1 mol·L-1盐酸湿润，加超纯水约40 mL搅拌至溶解，用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至中性，转移至50 mL容量瓶，加水定容；(2)25 mg·mL-1盐酸恩诺沙星注射液，称取1.25 g盐酸恩诺沙星于100 mL小烧杯中，加约25 mL 0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液搅拌至溶解，用0.5 mol·L-1盐酸调节pH值至中性，转移至50 mL容量瓶，加水定容；(3)10 mg·mL-1诺氟沙星注射液：称取0.50 g诺氟沙星于100 mL小烧杯中，加约25 mL 0.2 mg·L-1氢氧化钠溶液搅拌至溶解，用0.5 mol·L-1盐酸调节pH值至中性，转移至50 mL容量瓶，加水定容。每种注射液分别用针式滤器过0.22 μm膜，无菌分装成10管，加标识后，4 ℃保存备用。

给药：从雪山麻鸡群中选取个体质量约为1.5 kg的母鸡，根据给药品种分3组，每个实验组取10只， 在其翅膀上加组别标识，第1组按5 mg·kg-1的剂量胸肌注射盐酸环丙沙星溶液约0.75 mL，每天2次，连用2 d；第2组以同样剂量每只注射恩诺沙星溶液约0.3 mL；第3组以10 mg·kg-1每只注射诺氟沙星溶液约1.5 mL，分别在2个点位的左、右胸肌各注射约0.75 mL (表1)。给药期和停药期间，各实验组与对照组鸡混养，喂养方式仍以投喂谷物为主，兼采食一些菜叶、草叶和小虫。

人和的思想融入到与竞争对手的关系中，对手不是一直处于与自己对立的位置，有时候对手恰好是能保证企业常青的动力。

采样：在停药后48 h和第9天，分2批宰杀试验鸡，每批每个试验组各宰杀5只，以同批喂养未用药且个体质量约为1.5 kg的母鸡作为对照；分别取其胸肉、肝脏、血液和卵泡，因单只麻鸡的卵泡量少，将每个试验组同批卵泡合并，用均质器绞碎制成一个样；肝脏和凝固的血液也同样处理；将同一试验组同批的胸肉全剪成约1～2cm小块，混匀，用四分法取其中一半，绞碎制成1个样品；给12个试验组试样和4个对照组试样分别加标识，-20 ℃保存，待检。

表1三种喹诺酮的给药剂量

Table 1Dosage of three QNs

组别药品名称注射液浓度/(mg·mL-1)注射量/(mg·kg-1)注射部位(点数)1环丙沙星105胸肌(1)2恩诺沙星255胸肌(1)3诺氟沙星1010胸肌(2)

1.2.3LC-MS/MS法检测

组织样品预处理：称取2.00 g样品于50 mL离心管中，每个样品称取2份做平行样， 加入10 mL乙腈溶液，漩涡混匀，超声5 min，3 220g离心5 min，将乙腈转入100 mL棕色分液漏斗中，用10 mL乙腈重复提取1次，转入分液漏斗。提取液中加入10 mL乙腈饱和正己烷溶液，振荡5 min，将底层乙腈溶液转入棕色鸡心瓶中，加入5 mL正丙醇，45 ℃旋转蒸发近干，用乙腈转移至15 mL离心管，氮气吹干。准确加入2 mL体积分数为30%的乙腈水溶液超声30 s，加入4 mL乙腈饱和正己烷，旋涡离心5 min，弃去正己烷，取底层乙腈—水溶液过0.22 μm滤膜，待上机测定。

鸡蛋和卵泡样品预处理：称取2.00 g样品于15 mL试管中，每个样品称取2份做平行样，加入4 mL以体积分数为2%(V∶V)甲酸酸化的乙腈溶液，漩涡混匀，超声3 min，3 220g离心5 min，取上清，沉淀用4 mL酸化乙腈重复提取1次，合并上清，定容至25 mL。提取液中加入10 mL乙腈饱和正己烷溶液，振荡5 min，弃去上层正己烷，重复净化1次。下层溶液用氮气吹干，再准确加入1 mL甲醇溶解，然后加入1 mL水超声30 s，过0.22 μm滤膜，待上机测定。

LC-MS/MS测定的仪器条件：流动相A液为100%乙腈；B液体积分数为0.1%甲酸水溶液，其他条件参照标准[11]，根据色谱保留时间，每种化合物选择3个碎片离子为定性离子以获得高选择性，选取每个化合物丰度最高的碎片为定量离子以获得高灵敏度；通过计算峰面积外标法定量，按标准方法计算样品中每种待测组分的含量，测定结果(Xi)用平行测定的算术平均值表示。

2结果与分析

2.1鸡蛋及加标样品的胶体金法检测结果

2.2LC-MS/MS法检测结果

试验发现喹诺酮类药物在麻鸡体内的转化现象非常明显，每种药物经转化后可检测到6种以上喹诺酮类药物残留；所检的12种喹诺酮类药物中检出率和残留量最高的是环丙沙星，其次是诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星和恩诺沙星，再次是丹诺沙星，氟甲喹几乎未检出，沙拉沙星和麻保沙星仅在后续的沙拉沙星代谢试验中被检出，未检出洛美沙星和双氟沙星，最常检出的6种喹诺酮药物的定性、定量离子对和保留时间见表2。

图1　鸡蛋样品中喹诺酮残留的免疫胶体金法检测结果Fig.1　The quinoiones residue in egg samples determined by the immune colloidal gold detection

检测结果表明，喹诺酮类药物在肝脏和卵泡中总残留量较高:停药48 h， QNs残留总量达6 199.5～8 327.4 μg·kg-1(表3)；停药第9天，

表2六种喹诺酮药物的定性和定量参数

Table 2Qualitative and quantitative parameters of six QNs drugs

药物定性离子对定量离子对保留时间/minCip332.1>314.1332.1>288.12.58Enr360.3>245.2360.3>316.32.83Ofl362.2>261.2362.2>318.22.56Nor320.2>233.2320.2>276.32.54Eno321.1>303.1321.1>232.02.53Pef334.2>316.2334.2>290.22.59

表3麻鸡不同组织中喹诺酮类药物残留量

Table 3The QNs residues in different tissues of Partridge chickens

注射药物取样部位停药天数/d残留量/(μg·kg-1)FluNorEnoCipPefLomDanEnrOflMarSarDifQNs(对照)胸肉—0003.60001.71.40006.7肝脏—0000000000000全血—0000000000000卵泡—0000000000000环丙沙星胸肉2000273.41.30012.41.9000289.1900011.50002.11.000014.6肝脏20334.953.65481.1683.301.80101.10006655.8901.51.1298.664.901.803.9000371.8全血2000117.400001.6000119.090002.500000002.5卵泡2000452.92.40003.1000458.4900012.40001.3000013.7

续表3

诺氟沙星及其转化产生的QNs残留总量还有1 774 μg·kg-1；在肌肉和血液中药物的残留量相对较少而且代谢快，停药48 h，QNs总残留量为14.0～289.1 μg·kg-1；停药第9天，QNs总残留量降为2.5～18.5 μg·kg-1；对照组在肝脏、血液和卵泡中均未检出QNs(图2)，仅在胸肌中检出极少量QNs，可能是鸡苗防病用药残留。

A: 对照组质谱图，B～F: 停用Enr 48h的Cip, Nor, Pef, Eno, OFL定性离子和定量离子质谱图。图2　卵泡中QNs质谱图Fig.2　The mass chromatogram of QNs in follicles

2.3环丙沙星在麻鸡体内的转化和分布规律

环丙沙星在麻鸡体内的转化率相对较低，在肝脏中48 h和第9天的总转化率分别为17.6%和19.7%，肝脏中主要转化产物为培氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星和依诺沙星，转化率分别为10.3%，5.0%，1.5%和0.8%；肌肉中的主要转产物为恩诺沙星，转化率为4.3%。QNs的富集程度为肝脏>卵泡>胸肌>血液，48 h的总残留量分别为6 655.8，458.4，289.1和119.0 μg·kg-1，第9天的样品除肝脏中QNs为371.8 μg·kg-1外，其他3种组织的QNs残留量都降至≤14.6 μg·kg-1。

2.4恩诺沙星在麻鸡体内的转化和分布规律

恩诺沙星在麻鸡体内的特点是转化率高、在卵泡中高度富集、产物代谢慢。停药48 h时，在肝脏、血液和卵泡中转化率高达100%；其代谢产物在不同组织中的富集程度为卵泡>肝脏>胸肉>血液，停药48 h肝脏中QNs为2 580.9 μg·kg-1；停药第9天，肝脏中QNs仍有240.0 μg·kg-1；4种组织中，药物残留总量最高的是停药48 h的卵泡样品，QNs残留总量高达8 327.1 μg·kg-1，为同期肝脏中QNs残留量的3.2倍，该样品中同时检出6种QNs，其中环丙沙星、培氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星和氧氟沙星含量分别为7 164.1，533.9，481.3，77.4和68.2 μg·kg-1(图2)及少量的丹诺沙星，未检出恩诺沙星；停药第9天，卵泡中QNs还有244.4 μg·kg-1。

2.5诺氟沙星在麻鸡体内的转化与分布规律

诺氟沙星在麻鸡体内转化所生成的QNs在不同组织中富集程度与环丙沙星相似：肝脏>卵泡>胸肌>血液；其特点是：(1)尽管用药量是环丙沙星的2倍，停药48 h，各种组织中的QNs总量均低于注射Cip所产生的QNs总量，肝脏中QNs残留量为6 199.5 μg·kg-1，但代谢慢，停药第9天，其QNs仍有1 773.7 μg·kg-1。(2)肝脏中所生成的QNs品种较多且比例较均衡，其中Cip，Nor和Eno分别占36.9%，29.5%和29.2%(图3)。(3)与恩诺沙星相比转化率较低，停药48 h时，肝脏和卵泡中转化率分别60.8%和32.2%。

图3　肝脏各种QNs所占比例Fig.3　The rate of QNs in liver

3结论与讨论

试验结果表明：不同组织中QNs残留量差异大，肌肉和血液中QNs残留量低且代谢快(休药9 d，残留量低于19 μg·kg-1)；但肝脏和卵泡QNs残留量相对较高，与刘俊华等[12]报道的肉鸡肝脏中QNs的消除比肌肉中慢情况相符；Cip，Enr，Nor停药第9天鸡肝中的QNs均>100 μg·kg-1，与周凡等[13]报道恩诺沙星对中华鳖肝脏酶活的影响至少持续到注射后10 d相似。针对各种动物不同用药量及各种用药方式休药期的制定需要更多实验数据的支撑，使之更加具体化。

环丙沙星、恩诺沙星和诺氟沙星在麻鸡体内经转化后均生成6种以上QNs，说明单种喹诺酮药物在动物体内可转化生成多种喹诺酮药物，甚至使用兽用QNs药物品种如Enr可在动物体内转化生成多种人用QNs药物：Cip，Nor，Eno和Ofl；不但恩诺沙星可转化成环丙沙星，环丙沙星也有少量转化成恩诺沙星，说明在动物体内喹诺酮类药物之间存在复杂的转化关系，其他QNs的转化规律有待进一步深入研究。

环丙沙星和诺氟沙星及其转化产物在肝脏富集，但恩诺沙星转化生成的QNs在卵泡中高度富集，最高达8 327.3 μg·kg-1，为肝脏中的3.2倍，因此，恩诺沙星在鸡上的使用，鸡蛋中可能产生大量的QNs残留。目前，杭州市售禽蛋中QNs药物残留率高的现象与2006年王长青[14]报道的东台市鸡蛋中QNs残留的情况相似，而且前者比后者更为严重，可能与近几年禽流感的爆发及细菌耐药性逐渐上升促使养殖业增加用药有关。出于对食品安全和人类用药安全的考虑，应加强动物源性食品和农产品中喹诺酮类药物残留的监测，尽快推进市场准入和产地准出制度实施，与之配套的现场快速检测方法的研究开发也十分必要。

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(责任编辑卢福庄)

Studies on transformation and distribution rules of quinolones in Partridge chicken

LIU Ai-chun1， LIU Chao1， ZHAO Yun1， CHEN Xiao-hui2

( 1.HangzhouAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310024，China; 2.ZhilyuEcologicalAgricultureDevelopmentCo.，Ltd.，Hangzhou311121，China)

Abstract:The Partridge chickens whose eggs were quinoiones (QNs) negative tested by the immune colloidal gold rapid detection were used as the experimental materials. The chickens were injected twice each day for two consecutive days with 5 mg·kg-1ciprofloxacin， 5 mg·kg-1enrofloxacin and 10 mg·kg-1norfloxacin， respectively. LC-MS/MS analysis was performed to detect the residues of twelve quinoiones in muscle， liver， blood and follicles. The results showed that each drug could be converted into six or more QNs drugs in chicken. Moreover， the residual amount of QNs varied in different tissues. The QNs residues in muscle and blood were lower and had faster metabolic rate (the residues were less than 19 μg·kg-1at the 9th withdrawal day) than those of other tissues， while the residual amount of QNs were higher in liver and follicles. The ciprofloxacin， norfloxacin and their transformation products were enriched in liver， and the norfloxacin metabolism rate in liver was slow (the residue of QNs was 1 773.7 μg·kg-1at the 9th withdrawal day). The enrofloxacin in chickens was rapidly converted into other QNs， which was highly enriched in follicles. The conversion rate of enrofloxacin was up to 100% in liver， blood and follicles at the 48th withdrawal hour after injection with enrofloxacin. The residues of QNs in follicles was up to 8 327.3 μg·kg-1. Therefore， the use of enrofloxacin in layers might result in large amounts of QNs residues in eggs.

Key words:quinolones; transformation; Partridge chicken; LC-MS/MS; residue

DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2016.05.04

收稿日期：2015-11-24

基金项目：杭州市社会发展科研专项(20130533B24)

作者简介：柳爱春(1972—)，女，浙江永康人，高级工程师，从事农产品安全检测和相关的科研工作。E-mail： liuaichun01@163.com

中图分类号：S859.79+6

文献标志码：A

文章编号：1004-1524(2016)05-0736-07

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(5): 736-742

http://www.zjnyxb.cn

柳爱春，刘超，赵芸，等. 喹诺酮类药物在麻鸡体内的转化和分布规律 [J].浙江农业学报，2016，28(5): 736-742.