去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达

常英英，梁立雄，高亚南，王颜波，丁昌俊，苏晓华，张冰玉

(中国林业科学研究院 林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091)

去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达

常英英，梁立雄，高亚南，王颜波，丁昌俊，苏晓华，张冰玉*

(中国林业科学研究院 林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091)

摘要：植物去甲基化酶ROS1是表观遗传中一种重要的作用因子，参与基因的表达调控，与植物的生长发育及各种逆境响应过程密切相关。以拟南芥AtROS1基因为目的基因，采用“酶切—连接”的方法构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的植物表达载体pER8-ROS1。将其转入农杆菌LBA4404菌株中，通过烟草瞬时表达技术，对该载体的诱导表达特性进行了研究。qPCR结果表明：17-β-雌二醇处理能够有效调控pER8-ROS1中目的基因的表达，17-β-雌二醇最佳诱导浓度为50～100 μmol·L-1；随着诱导时间的延长，目的基因表达量逐渐升高，在12 h后达到最高。该诱导表达载体的构建为研究植物抗逆胁迫过程中的表观遗传机制奠定了基础。

关键词：pER8-ROS1；17-β-雌二醇；化学诱导表达载体；瞬时表达

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，是植物正常生长发育所必需的，也是植物逆境响应的重要机制。DNA甲基化的水平主要靠DNA甲基化和去甲基化的作用调节，这2个过程相互平衡，维持了DNA甲基化模式的稳定。植物基因组甲基化模式的形成主要依赖于主动去甲基化，因此主动去甲基化的研究逐渐成为甲基化研究领域的重点之一。在植物中可能存在5种DNA主动去甲基化机制：DNA糖基化酶参与的碱基切除修复机制(base excision repair，BER)、脱氨基作用及G/T碱基错配修复机制、核酸切除修复机制、氧化去甲基化机制及水解去甲基化[1]。DNA去甲基化酶参与DNA主动去甲基化过程，并且占主导地位。植物中的去甲基化转移酶主要有DME，ROS1，DML2和DML3 4个家族，它们均含有最保守的DNA糖基化酶结构域[2-4]。其中，ROS1是植物体内第一个被克隆的去甲基化酶基因；植物通过ROS1家族介导的碱基切除修复(BER)机制实现DNA主动去甲基化[3]。在BER途径中，ROS1双功能团酶切除甲基，使脱氧核糖和5-mC之间的核苷键断裂，产生DNA链上的AP(apurillic/apyrimidinic)位点，ZDP和APE1L将3′磷酸变成3′羟基，最后，由DNA聚合酶和DNA连接酶填补此缺口，最终C取代5-mC[5-6]。ROS1是该通道中发挥作用的主要功能蛋白。拟南芥ROS1功能缺失突变体研究表明，ROS1能够使目的基因启动子发生去甲基化，激活沉默基因的表达，从而调控植物生长发育及对环境胁迫的应答[3，7-10]。另外，ROS1还可以阻止RNA介导的DNA甲基化[11-13]。因此，研究ROS1的生物学功能对于丰富DNA主动去甲基化的机制，了解植物生长发育的调控机制，以及采用分子育种手段定向培育抗逆性强的树木新品种都具有重要价值。

化学诱导表达系统是研究基因功能的有效手段之一[14]。其中，类固醇激活系统是基于糖皮质激素受体、雌激素受体等建立的较为精密的化学诱导表达系统，其主要是通过糖皮质激素受体、雌激素受体作为转录激活因子与融合启动子结合，来调控下游基因的表达。当类固醇存在时，受体从细胞质的热休克蛋白90(HSP90)中解离出来，转移到细胞核中，并与融合启动子结合，激活目的基因的表达。2000年，Zuo等[15]构建了雌激素激活表达系统(XVE系统)，该系统能够精密地调控下游基因的表达，并且对植物没有毒害作用，是研究基因功能的理想工具。

本研究以拟南芥去甲基化酶基因AtROS1为目的基因，构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的XVE系统载体pER8-ROS1，将其转入农杆菌LBA4404菌株中，通过烟草(NicotianatabacumL.)瞬时表达，对该载体的诱导表达特性进行了研究，为研究DNA去甲基化与植物生长发育以及抗逆胁迫之间的相互关系奠定了基础。

1材料与方法

1.1植物材料

烟草由中国林业科学研究院林业研究所卢孟柱课题组馈赠。播种于土壤中，并将其放入(26 ± 1)℃，16 h·d-1光照和50 μmol·m-2·s-1光强的人工气体培养箱中培养。60 d后用于农杆菌介导的基因瞬时表达。

1.2菌株、质粒及试剂

含有雌二醇诱导型启动子的pER8-GFP质粒由Nam. Hai Chua博士(The Rockefeller University，USA)赠送，含拟南芥AtROS1基因cDNA的pET28a-ROS1质粒由Roldn-Arjona博士(Universidad de Córdoba，Spain)赠送。农杆菌LBA4404为本实验室保存。

1.3试验方法

1.3.1拟南芥ROS1基因诱导表达载体构建

GenBank中AtROS1基因CDS区序列长度为4 182 bp，利用Primer 5.0设计特异性引物ROS1-F (5′-CCGCTCGAGATGGAGAAACAGAGGAGAGAAGA-3′)和ROS1-R (5′-CTAGACTAGTACGGATTAGGCGAGGTTAGC-3′)(下划线分别表示XhoⅠ和SpeⅠ酶切位点)，以pET28a-ROS1质粒为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为20 μL，包括10 × GC buffer 2 μL，200 μmol·L-1dNTPs 2 μL，0.2 μmol·L-1PCR引物各1 μL，5×16.67 mkat·L-1Taq酶0.2 μL，500 ng·μL-1模板1 μL，ddH2O 12.8 μL；扩增程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，35个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的片段，连接到克隆载体pMDTM19-T Vector(Takara公司，日本)。转化EscherichiacoliDH5α，经过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆进行序列测定。

用XhoⅠ和SpeⅠ酶切pMDTM19-T-ROS1和pER8-GFP质粒，酶切回收的ROS1片段和pER8线性片段，用T4 DNA酶连接，挑取单克隆进行PCR检测，所用引物在载体pER8多克隆位点设计(pXhoⅠ-F: 5′-CGCTGAAGCTAGTCGACT-3′；pSpeⅠ-R: 5′-AGGCCTGGATCGACTAGT-3′)。将阳性克隆扩大培养后，提取质粒进行双酶切验证。菌液加入20%的甘油保种备用，质粒于-20 ℃保存。植物诱导表达载体pER8-ROS1的结构如图1所示。

1.3.2pER8-ROS1载体的诱导表达特性研究

图1　植物诱导表达载体pER8-ROS1结构示意图Fig.1　The structural diagram of the plant chemical inducible expression vector pER8-ROS1

烟草处理方法。用电击法分别将质粒pER8-GFP和pER8-ROS1转入农杆菌LBA4404，得到1#和2#菌株；其中1#菌株用于筛选诱导剂处理的条件，2#菌株在筛选出的诱导条件下进行pER8-ROS1载体的诱导表达特性研究。在含50 mg·L-1利福平和壮观霉素的YEP培养基中培养，于28 ℃，200 r·min-1培养直至D600为0.4～0.6，并用悬浮液处理。先用1#农杆菌重悬液注射烟草叶片，26 ℃控湿培养箱中培养12 h，再用17-β-雌二醇涂抹烟草叶面，处理浓度分别为0，0.08，0.20，1.00，5.00，25.00，50.00，100.00和200.00 μmol·L-1。对照组1(CK1)为未注射含pER8-GFP农杆菌的烟草，对照组2(CK2)为0 μmol·L-117-β-雌二醇处理的烟草，即注射含pER8-GFP农杆菌但无诱导处理的。12 h之后打孔取叶片，每个处理3次重复，每次重复约取样100 mg，立即投入液氮中，保存于-80 ℃冰箱中(下同)。同时，以50 μmo·L-117-β-雌二醇处理烟草叶面，并于0，0.5，1.0，3.0，6.0，12.0，24.0，48.0，96.0 h后取样。对照组(CK1)为未注射的烟草，对照组2(CK2)为诱导0 h的烟草。

用2#农杆菌重悬液注射烟草叶片，共培养12 h后用17-β-雌二醇涂抹烟草叶面，处理浓度为0，1，25，50，100和200 μmol·L-1，继续培养12 h之后取样。对照组1(CK1)为未注射的烟草，对照组2(CK2)为注射含pER8-ROS1农杆菌但无诱导的烟草。根据筛选出的最佳浓度，用17-β-雌二醇涂抹烟草叶面，处理时间分别为0，1，6，12，24和48 h，取样及保存方法同上。设立对照组同上。该材料用于检测pER8-ROS1载体中ROS1基因的诱导表达情况。

总RNA提取及cDNA合成。使用Qiagen公司RNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取不同处理的叶片总RNA，用Nano Drop 8000分光光度计测RNA的浓度和纯度。采用Reverse transcriptase-PCR方法合成cDNA，具体反应过程参照Takara公司的说明书进行。

实时定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)反应。以不同处理的稀释10倍的cDNA为模板，采用Roche LightCycle 480Ⅱ型荧光定量PCR仪进行qPCR反应。以actin为内参基因，采用2-ΔΔCt算法进行分析[16]，qPCR引物序列见表1。

表1qPCR引物序列

Table 1The primer sequences of qPCR

基因扩增长度/bp引物序列(5'→3')ROS1300ATGGAGAAACAGAGGAGAGAAGAGCTCAAACTCTCCACTTCTTCAGFP166TGTTCCATGGCCAACACTTGACGTGTCTTGTAGTTCCCGTactin195TGTGTTGGACTCTGGTGATGCGCTCGGTAAGGATCTTCATC

2结果与分析

2.1诱导表达载体pER8-ROS1的构建

用ROS1-F和ROS1-R引物扩增pET28a-ROS1质粒，获得4 182 bp的PCR片段，与预期带有酶切位点的全长AtROS1基因相符。纯化后连入pMDTM19-T载体，经过双端测序，证明克隆基因核酸序列与AtROS1基因完全相同，获得pMDTM19-T-ROS1中间载体。用XhoⅠ和SpeⅠ双酶切质粒pMDTM19-T-ROS1，获得4 197 bp的片段，将其连入植物诱导表达载体pER8-GFP中，替换GFP基因。采用pXhoⅠ-F和pSpeⅠ-R引物，进行PCR扩增，扩增出4 227 bp片段。XhoⅠ和SpeⅠ双酶切结果显示，酶切片段大小正确(图2)。表明成功构建了拟南芥去甲基化酶基因AtROS1的植物诱导表达载体pER8-ROS1。

2.2pER8-ROS1的诱导表达特性分析

2.2.1诱导剂浓度及诱导时间的确定

将含有pER8-GFP质粒的LBA4404菌株注射到烟草中，共培养12 h后检测不同浓度17-β-雌二醇处理下GFP基因的表达情况。图3-A显示，2个对照组均无特异性条带，且qPCR结果中对照组1的Ct值(>35)远大于对照组2以及处理组，说明GFP在对照组1中不表达。图4-A表明，17-β-雌二醇能有效诱导烟草瞬时表达系统中GFP的表达，随着17-β-雌二醇浓度增加，GFP的表达量逐渐增加。17-β-雌二醇浓度为0.2 μmol·L-1时，即可检测到GFP基因的表达，5 μmol·L-1时GFP基因的表达量显著增加，浓度达到50 μmol·L-1后，GFP的表达量增加趋势趋于平缓，因此，确定17-β-雌二醇有效浓度为5～50 μmol·L-1。

采用qPCR方法检测了在烟草瞬时表达体系中XVE系统的目的基因表达水平随17-β-雌二醇处理时间变化的趋势。结果表明：17-β-雌二醇处理1 h时即能检测到GFP基因的表达，随着处理时间的增加，GFP的表达量逐渐增加，3 h时GFP的表达量显著增加，在12 h时表达量最大，之后逐渐降低(图3-B，图4-B)

A： 质粒pER8-ROS1转化大肠杆菌菌液PCR检测。M: 1kb DNA marker；1～3: 3个单菌落的PCR结果。B: pER8-ROS1质粒双酶切。M: 1kb DNA marker；P: pER8-ROS1质粒；X+S: pER8-ROS1质粒XhoⅠ和SpeⅠ双酶切片段。图2　pER8-ROS1载体的PCR(A)和XhoⅠ+SpeⅠ双酶切(B)检测Fig.2　PCR identification (A) and XhoⅠ+SpeⅠdigestion (B) of the pER8-ROS1 vector

A： 不同浓度诱导剂处理GFP基因的半定量PCR检测。M: Marker I；-：CK1；0: CK2；0.08～200：诱导剂浓度分别为0.08～200 μmol·L-1的烟草样品。B：不同诱导时间GFP基因的半定量PCR检测。-：CK1；0: CK2；0.5～96：诱导时间分别为0.5～96 h的烟草样品。图4同。图3　GFP基因的半定量PCR检测Fig.3　sq-PCR indentification of GFP gene

图4　GFP对17-β-雌二醇浓度(A)和处理时间(B)的响应Fig.4　Dose-response(A) and induction time-course(B) of GFP to 17-β-estradiol

2.2.2pER8-ROS1中ROS1的诱导表达特性分析

在确定了17-β-雌二醇处理浓度和处理时间的基础上，对构建的ROS1基因化学诱导表达系统的诱导特性进行了研究。对照组1的半定量结果无条带(图5-A)，且qPCR结果无荧光信号，说明所设计的AtROS1引物不能扩增烟草中的NtROS1基因。qPCR结果表明，1～200 μmol·L-1的浓度范围内，17-β-雌二醇能够有效诱导ROS1的表达，并且随着17-β-雌二醇浓度增加，ROS1的表达量逐渐增加，17-β-雌二醇浓度达到100 μmol·L-1后，ROS1的表达量进入平台期(图5-B)。较低浓度的17-β-雌二醇也能有效诱导外源基因的表达，说明该载体对诱导剂的反应较为灵敏。但在同样浓度条件下，ROS1的表达量比GFP低。

在100 μmol·L-1的17-β-雌二醇处理下，烟草叶片中ROS1的表达量随处理时间而逐渐增加，处理1 h后ROS1即有少量表达，6 h后表达量略有上升，12 h后表达量达到高峰，之后缓慢下降(图5-C)。其表达趋势与GFP相似，但表达量较GFP低。

3结论与讨论

为了更加深入研究AtROS1基因在植物生长发育和逆境响应过程中的作用，选用雌激素激活系统构建了受17-β-雌二醇诱导表达的pER8-ROS1双元载体，并利用烟草的瞬时表达技术和qRT-PCR技术，检测了该系统中AtROS1基因随17-β-雌二醇处理条件变化的表达情况。研究结果表明：较低浓度的17-β-雌二醇即能有效诱导AtROS1的表达，处理12 h后表达量最高。Zuo等[15]在拟南芥转基因植株中研究发现，17-β-雌二醇处理浓度为5 μmol·L-1、处理时间为24 h时，XVE系统中目的基因表达量最大。而本研究中17-β-雌二醇浓度提高到50～100 μmol·L-1时，目的基因表达量才能达到最大，可能是因为本研究中诱导剂处理的方法为叶片涂抹法，诱导剂容易挥发，导致处理浓度降低；而拟南芥转基因研究中诱导剂处理的方法为根部吸收，这能为植物提供稳定的诱导条件[17]。本研究中17-β-雌二醇处理12 h后目的基因的表达水平达到最高，原因可能是恒定表达与瞬时表达方法不同导致的。本研究还发现，雌激素激活系统对GFP基因和AtROS1基因的调控水平也有差异，可能是由于基因片段大小不同导致转化效率的差异[18]。

A: AtROS1基因的半定量PCR检测。M: Marker I；wt: CK1；0: CK2；1～200：诱导剂浓度分别为1～200 μmol·L-1的烟草样品；1～48 h：诱导时间分别为1～48 h的烟草样品。B: pER8-ROS1载体对17-β-雌二醇浓度的响应。0: CK2；1～200：诱导剂浓度分别为1～200 μmol·L-1的样品。C: pER8-ROS1对17-β-雌二醇诱导时间的响应。0: CK2；1～48：诱导剂时间分别为1～48 h的样品。图5　表达载体pER8-ROS1的诱导表达特性分析Fig.5　Inducible characteristic analysis of expression vector pER8-ROS1

烟草的瞬时表达系统由于其省时省力、周期快、结果可靠等优点成为研究基因功能的有效手段[19]。本研究中用于构建化学表达载体的拟南芥AtROS1基因功能已经很明确，即通过去甲基化作用调控基因的表达[3]。在烟草瞬时表达试验中，诱导表达AtROS1会引起基因组的DNA甲基化变化。这种基因组甲基化的改变可以通过MSAP(methylation sensitive amplification polymorphis)，MeDIP(methyl-DNA immunoprecipitation)和BS-seq(bisulphite sequencing)的方法进行测定。然而，由于本研究仅是利用烟草的瞬时表达系统来确定构建载体的诱导特性，加之上述测定基因组甲基化的方法成本较高、烟草瞬时体系的不稳定性等原因，本文并未对诱导表达AtROS1后烟草叶片的甲基化情况进行测定。在获得稳定转化的转基因植株后，我们将选择部分植株进行有针对性的甲基化研究。

另外，拟南芥AtROS1基因与植物的抗逆性密切相关。在烟草中超表达AtROS1基因，烟草表现出较强的抗盐能力[20]。在拟南芥AtROS1基因的缺失突变体rdd中，对抗病性相关的基因检测表明，AtROS1基因在拟南芥的抗病性方面有重要作用[21]。此外，AtROS1基因有助于拟南芥种子打破休眠，其还能够通过RNA介导的DNA甲基化过程(RNA-directed DNA methylation，RdDM)来影响植物的耐热性等[22-23]。拟南芥AtROS1的化学诱导表达载体pER8-ROS1的成功构建，对于研究植物DNA主动去甲基化的机制，特别是采用分子育种手段定向培育抗逆性强的植物新品种具有重要意义。

参考文献：

[1]曹领改， 张旸， 蓝兴国， 等. DNA去甲基化机制的研究进展[J]. 现代生物医学进展， 2012， 12(1): 160-162.

[2]CHOI Y， GEHRING M， JOHNSON L， et al. DEMETER， a DNA glycosylase domain protein， is required for endosperm gene imprinting and seed viability inArabidopsis[J].Cell， 2002， 110(1): 33-42.

[3]GONG Z Z， RUIZ T M， ARIZA R R， et al. ROS1， a repressor of transcriptional gene silencing inArabidopsis， encodes a DNA glycosylase/lyase [J].Cell， 2002， 111(6): 803-814.

[4]ORTEGA-GALISTEO A P， MORALES-RUIZ T， ARIZA R R， et al.ArabidopsisDEMETER-LIKE proteins DML2 and DML3 are required for appropriate distribution of DNA methylation marks [J].PlantMolecularBiology， 2008， 67(6): 671-681.

[5]LI Y， CORDOBA-CANERO D， QIAN W， et al. An AP endonuclease functions in active DNA demethylation and gene imprinting inArabidopsis[J].PLoSGenet， 2015， 11(1): e1004905.

[6]ZHU J K. Active DNA demethylation mediated by DNA glycosylases [J].AnnualReviewofGenetics， 2009， 43(1): 143-166.

[7]AGIUS F， KAPOOR A， ZHU J K. Role of theArabidopsisDNA glycosylase/lyase ROS1 in active DNA demethylation [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica， 2006， 103(31): 11796-11801.

[8]CHANG-SUN C， HIROSHI S. Abiotic-stress induces demethylation and transcriptional activation of a gene encoding a glycerophosphodiesterase-like protein in tobacco plants [J].MelangesDeLaCasaDeVelzquez， 2007， 277(5): 589-600.

[9]PAVET V， QUINTERO C， CECCHINI N M， et al.Arabidopsisdisplays centromeric DNA hypomethylation and cytological alterations of heterochromatin upon attack by pseudomonas syringae [J].MolecularPlant-MicrobeInteractions， 2006， 19(6):577-87.

[10]ZHU J K. Epigenome sequencing comes of age [J].Cell， 2008， 133(3): 395-397.

[11]MATZKE M， KANNO T B， DAXINGER L， et al.TargetsofRNA-directedDNAmethylation[J].CurrentOpinioninPlantBiology， 2007， 10(5): 512-519.

[12]MATZKE M A， BIRCHLER J A. RNAi-mediated pathways in the nucleus [J].NatureReviewsGenetics， 2005， 6(1): 24-35.

[13]ZHANG C J， ZHOU J X， LIU J， et al. The splicing machinery promotes RNA-directed DNA methylation and transcriptional silencing inArabidopsis[J].TheEMBOJournal， 2013， 32(8): 1128-1140.

[14]张健， 徐金相， 孔英珍， 等. 化学诱导激活型拟南芥突变体库的构建及分析[J]. 遗传学报， 2005， 32(10): 1082-1088.

[15]ZUO J， NIU Q W， CHUA N H. Technical advance: An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants [J].PlantJournal， 2000， 24(24): 265-273.

[16]PFAFFL M W， HORGAN G W， DEMPFLE L. Relative expression software tool (REST©) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR [J].NucleicAcidsResearch， 2002， 30(9): e36-e36.

[17]LUDOVIC M， MELANIE D， ERIC B， et al. The zinc finger protein PtaZFP2 negatively controls stem growth and gene expression responsiveness to external mechanical loads in poplar [J].NewPhytologist， 2014， 203(1): 168-181.

[18]朱俊华， 竺晓平， 温孚江， 等. 马铃薯Y病毒衣壳蛋白基因片段长度对RNA介导抗病性的影响[J]. 中国科学(生命科学)， 2004， 34(1): 23-30.

[19]QIAO J B， ISHIHARA Y， KURODA H， et al. Transient expression of goat growth hormone gene in poplar (PopulusalbaL.) protoplasts: a quick method for detection of foreign gene expression in mRNA level [J].Bioscience，BiotechnologyandBiochemistry， 1997， 61(9): 1580-1581.

[20]BHARTI P， MAHAJAN M， VIAHWAKARMA A K， et al.AtROS1 overexpression provides evidence for epigenetic regulation of genes encoding enzymes of flavonoid biosynthesis and antioxidant pathways during salt stress in transgenic tobacco [J].JournalofExperimentalBotany， 2015， 6(19): 5959-5969.

[21]LE T N， SCHUMANN U， SMITH N A， et al. DNA demethylases target promoter transposable elements to positively regulate stress responsive genes inArabidopsis[J].GenomeBiology， 2014， 15(9): 458.

[22]FOOTITT S， MULLER K， KERMODE A R， et al. Seed dormancy cycling inArabidopsis: chromatin remodelling and regulation of DOG1 in response to seasonal environmental signals [J].PlantJournal， 2015， 81(3): 413-425.

[23]NAYDENOV M， BAEV V， APOSTOLOVA E， et al. High-temperature effect on genes engaged in DNA methylation and affected by DNA methylation inArabidopsis[J].PlantPhysiology&Biochemistry， 2015， 87: 102-108.

(责任编辑侯春晓)

Construction of a chemical-inducible expression vector ofAtROS1 and its transient expression in tobacco

CHANG Ying-ying， LIANG Li-xiong， GAO Ya-nan， WANG Yan-bo， DING Chang-jun， SU Xiao-hua， ZHANG Bing-yu*

(StateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreeding/KeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivationofStateForestryAdministration/ResearchInstituteofForestry，ChineseAcademyofForestry，Beijing100091，China)

Abstract:Plant demethylase ROS1 was an important factor in epigenetic regulation. It could activate the expression of genes and was closely related to the processes of plant development and various stress responses. In this study， AtROS1 gene from Arabidopsis thaliana was used as the target gene， and ‘digestion-ligation’ method was applied for constructing plant expression vector pER8-ROS1 which could be induced by 17-β-estradiol. Then the vector was transferred to Agrobacterium tumefaciens LBA4404， and the inducible expression characteristics were verified by the transient expression system of Nicotiana tabacum. The results of qPCR showed that 17-β-estradiol could effectively induce the expression of the target gene in pER8-ROS1 and the optimal concentration of 17-β-estradiol was 50 to 100 μmol·L-1. The expression level of ROS1 gene gradually increased and reached the highest level at 12 h. The construction of pER8-ROS1 laid a good foundation for the epigenetic mechanism study in plant environmental stress.

Key words:pER8-ROS1; 17-β-estradiol; chemical-inducible expression vector; transient expression

DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2016.05.01

收稿日期：2015-09-22

基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)(2013AA102703)；林木遗传育种国家重点实验室基本科研业务费专项资金(TGB2013010)

作者简介：常英英(1987—)，女，河南新乡人，硕士研究生，研究方向为林木基因工程。E-mail: 15510642172@163.com

*通信作者，张冰玉，E-mail: byzhang@caf.ac.cn

中图分类号：Q943.2

文献标志码：A

文章编号：1004-1524(2016)05-0717-07

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(5): 717-723

http://www.zjnyxb.cn

常英英， 梁立雄， 高亚南， 等. 去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达[J]. 浙江农业学报， 2016， 28(5): 717-723.