盐胁迫下紫花苜蓿突变体形态结构特征和水分利用效率的研究

郭　鹏，李琳琳，金　华，邹吉祥，鲍雅静

(大连民族大学 环境与资源学院 ，辽宁 大连 1166005)



盐胁迫下紫花苜蓿突变体形态结构特征和水分利用效率的研究

郭鹏，李琳琳，金华，邹吉祥，鲍雅静

(大连民族大学 环境与资源学院 ，辽宁 大连 1166005)

摘要：通过盐胁迫实验对紫花苜蓿突变体根部各项指标进行了研究，进一步深刻了解了紫花苜蓿的耐盐性。利用根系扫描仪和根系分析系统，测定了盐碱混合胁迫下紫花苜蓿突变体根系形态结构变化，包括根总面积、根总长度、平均直径和根尖数。通过测定盐胁迫下气孔导度、净光合速率、蒸腾速率和水分利用效率，分析其与根系响应机制。结果显示，不同盐浓度下苜蓿根系形态均有不同程度的变化，轻度盐胁迫可以促进其生长，当盐分持续升高时才表现出明显的抑制作用。

关键词：盐胁迫 ；紫花苜蓿 ；蒸腾速率(Tr) ；气孔导度(Gs) ；光合速率(Pn) ；水分利用效率(WUE)

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一种多年生优质豆科牧草，它具有营养价值高，粗蛋白、维生素和矿物质含量丰富，氨基酸的组成齐全，适口性好等特点，是中国重要的植物性蛋白饲料，在农牧业生产和生态经济建设中发挥着巨大作用[1-5]。紫花苜蓿在豆科牧草中的抗盐性较强，种植紫花苜蓿的草地表层土壤中可溶性盐含量明显下降，土壤肥力有所提高。由于紫花苜蓿品种的耐盐性鉴定和筛选是紫花苜蓿耐盐品种选育的基础，近年来国内外许多学者对紫花苜蓿耐盐性及相关内容进行了研究[6-9]。

本研究以紫花苜蓿为研究对象，利用形态学、生理学等技术手段以及耐盐指标的测定，研究了紫花苜蓿突变体适应盐分变化的形态结构学特征和细胞内生理特性变化规律，从植物耐盐性基础的形态结构和植物耐盐性表征的生理特性综合探讨了紫花苜蓿的耐盐特性。通过揭示盐胁迫下紫花苜蓿的适应性变化规律，为扩大盐渍地上紫花苜蓿的种植面积并有效提高其产量和品质提供了参考。通过本项研究可初步判定紫花苜蓿的耐盐性能，将其应用到国内盐碱地改造的工程中，对改善生态环境，增加可用土地面积，增加粮食产量，造福人类，具有重大的意义。

1材料与方法

1.1材料

供试紫花苜蓿为耐盐突变体ZHMX-MY-24。以紫花苜蓿公农二号 (耐盐指数≤0.5，耐盐级别为4级)下胚轴为外植体，诱导获得愈伤组织，经甲基磺酸乙酯(EMS)处理后，在1/2海水浓度MS培养基上筛选获得了耐半海水的突变体，经盐池反复选择，得到了耐盐株系ZHMX-MY-24(耐盐指数≥1.3，耐盐级别为1级)。

1.2方法

1.2.1发苗

将所需的苜蓿种子取若干，挑选大小一致、饱满的不同品种紫花苜蓿种子，经消毒处理后放入有湿润滤纸的培养皿中置于光照培养箱，昼夜培养温度25℃，每天补充所失水分，培养10 d左右，胚根突破种皮2 mm并至少有1片或2片子叶保留2/3以上(不包括2/3)认为萌发。

1.2.2移栽

为保证在取出根系时不使其受损，使用蛭石作为基质。培养土为营养土和蛭石以2:1的比例混合体。每盆放入适量的培养土，用玻璃棒在盆中按出均匀的5个洞，将两个品种萌发好的幼苗移栽到每个花盆里，每个洞放入2～5棵苗。移栽后用晒好的自来水浇透，缓苗3 d，使幼苗可以适应新环境。每隔3 d浇水一次。

1.2.3胁迫

移栽后30 d需要进行盐碱胁迫。胁迫前2 d不浇水。NaCl盐溶液：A对照 (0 mmol·L-1)、B低盐(50 mmol·L-1)、C中盐(150 mmol·L-1)、D高盐(250 mmol·L-1)各100 mL分别进行处理。每个处理重复3次。盐浓度及对应的质量见表1。

表1　盐浓度及对应的质量

1.2.4取样及测量数据

根系形态实验：盐胁迫30 d后，将整盆植株完整倒出并用去离子水清洗干净，吸干表面水分，将其浸入1 %的结晶紫溶液中染色后，放入50 %的乙醇溶液中置冰箱备用。扫描前需再用去离子水冲洗根系，而后将根系放入装有去离子水的透明盘中进行扫描。扫描图片用Delta-t scan软件进行分析，包括根系形态学参数：根总面积、根总长度、平均直径和根尖数。

蒸腾和水分利用效率实验：盐胁迫24 d以后，选取倒数第3片完全展开的健康完整叶片活体测定紫花苜蓿叶片的光合生理指标，每个处理重复3次，利用Licor-6400 光合便携仪(美国)分别测定田间和盆栽苜蓿在不同盐浓度的光合参数，所有测定均在09:00 —11:00 内完成。光合有效辐射( PAR) 控制在800 μmol ·m-2s-1，实验参比气体采自温室顶部，CO2浓度约为400 μmol ·mol-1，环境温度和大气湿度没有特别控制。测定的主要光合作用参数有：净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)。植物水分利用效率(WUE)的测定：WUE=Pn /Tr。

2结果与分析

2.1不同盐胁迫对全株根系形态特征的影响

盆栽盐胁迫对紫花苜蓿根系形态特征的影响见表2。

表2　盆栽盐胁迫对紫花苜蓿根系形态特征的影响

从表2中的全株根系形态指标可以看出，盐分对紫花苜蓿根总面积、根总长度、平均直径及根尖数均有影响。轻度盐处理下，根总面积都增加，而根总长度和根尖数的增加与对照相比呈现显著性差异，说明在此盐浓度下紫花苜蓿根系受到轻微的水分胁迫，为缓解这一伤害，根总面积、根总长度、根系的平均直径和根尖数随之增加，以便从土壤中吸收更多的水分。而中度盐处理时，通过对根系的观察，根系的平均直径和根总长度显著低于轻度盐处理(P<0.05)，但还高于对照。根系在中度盐处理时的上述根系指标都低于对照，这可能是由于盆栽紫花苜蓿的根系还未发育成熟，更容易受到盐分的影响。重度盐处理下的紫花苜蓿幼苗根系的各项参数下降明显。

2.2根系形态特征与盐浓度的相关性分析

为进一步确定根系形态特征和盐浓度的关系，对根系形态特征和盐浓度的相关性(见表3)进行分析。由表3可以清晰的反映出各参数之间的相关性。实验得出，盐浓度与根总面积显著负相关，与平均直径和根尖数极显著负相关，但未与根总长度达到显著水平。

表3　盆栽试验中盐浓度与紫花苜蓿根系

注：*代表相关；**代表极相关

田间紫花苜蓿根系在盐处理后的形态变化如图1。可以看到，对照组与轻度盐胁迫组的根系发达，轻度盐处理下的根长度和侧根数量要比对照组多，而中度盐和重度盐处理则明显少于对照组，且有部分根已经死亡。

2.3不同浓度盐胁迫对紫花苜蓿水分利用效率(WUE)的影响

气孔导度表示气孔张开的程度，其影响光合作用及蒸腾作用，同时与蒸腾作用呈正比。潜在气孔导度指数可以在一定程度上表示植物叶片最大的光合能力。各处理的紫花苜蓿叶片潜在气孔导度指数见表4。在轻度盐处理下气孔导度要高于对照，而随着盐浓度的增高，气孔导度开始下降。这说明，轻度盐处理下，植物受到轻度的水分胁迫，由于根系的变化导致植物体内的水分含量增加，导致气孔导度也增加。

图1　田间紫花苜蓿根系在盐处理后的形态变化

A. 未加盐处理; B. 轻度盐处理;C. 中度盐处理; D. 重度盐处理

表4　各处理的紫花苜蓿叶片潜在气孔导度指数

蒸腾作用(transpiration)是水分从活的植物体表面(主要是叶子)以水蒸气状态散失到大气中的过程，与物理学的蒸发过程不同，蒸腾作用不仅受外界环境条件的影响，而且还受植物本身的调节和控制，因此它是一种复杂的生理过程[10-11]。太阳辐射和大气CO2浓度等环境因子直接地控制植物的光合作用、蒸腾作用、气孔导度和水分利用效率,同时它们也对环境变化做出相应的反应，具有很强的自我调节和适应能力[12-15]。气孔作为CO2和水气进出的共同通道，微妙地调节着碳固定和水分平衡关系,但光合产物和水分的运输系统和方向是不相同的:一方面,叶片通过调节气孔导度可以使碳固定达到最大,另一方面,气孔行为还受光合产物的反馈抑制,这就造成了气孔对CO2和水气扩散的不同步,进而影响植物的水分利用效率。植物遭受多种逆境胁迫时,最终都直接或间接归结到水分代谢的紊乱,因此WUE的高低较好的体现了抗逆境的能力。为了进一步了解盐胁迫下紫花苜蓿根系与地上植物体内水分的关系，本实验测定了盆栽条件下不同盐浓度处理的蒸腾速率和光合速率并计算出水分利用效率。三者随盐浓度的变化规律如图2-图4。

图2　蒸腾速率随盐浓度的变化规律

图3　紫花苜蓿净光合速率随盐浓度变化规律

图4　水分利用效率随盐浓度变化规律

Tr和WUE在不同盐浓度胁迫下的变化趋势是一致的，即WUE先上升后下降, Tr一直呈下降趋势。在无胁迫处理时，第25 h时，实验测得的WUE数值为3.44 μmol·mmol-1。但在轻度盐处理下，除了第15 h外，WUE均高于对照。随着盐浓度的增加，WUE不断下降，重度盐处理下降至最低。而Tr试验中随着盐胁迫的加重一直不断降低，直到严重盐胁迫时降至最低。这说明，轻度盐胁迫促进了植物WUE、Tr、Pn都有所上升，而中度和重度盐胁迫则严重影响了植物的水分利用效率，导致所有指标都有所下降，重度时为急剧下降。

3讨论

(1)在不同盐胁迫对田间不同土壤深度根系影响过程中，在轻度盐处理下均较对照显著增加，随着盐处理程度的加大，根总面积开始下降，且重度盐处理时显著低于对照。上述数据说明轻度盐处理对紫花苜蓿根总面积有促进作用，中度胁迫对根总面积影响与对照比较差异不显著，重度盐处理使紫花苜蓿根总面积下降。根系平均直径在轻度和中度盐处理下，变化不显著，在重度盐处理下才显著低于对照。其原因归结为在轻度盐胁迫下，紫花苜蓿根系相应机制启动，包括相关基因被诱导表达，进而促进根系的生长[12]。

(2)在不同盐处理下全株根系形态的特征参数分析过程中，轻度盐处理下促进了根系的生长发育，增加了其对盐分的适应性。而中度盐处理下紫花苜蓿根总面积和根尖数开始显著低于对照(r<0.05)，但根总长度和平均直径并未与对照达到显著水平，重度盐处理下除平均直径未与对照达到显著差异外，根总面积、根总长度和根尖数均显著低于对照(r<0.05)，说明此时紫花苜蓿根系的生长受到极大地抑制。盐胁迫下紫花苜蓿根面积、根长度、根尖数、根平均半径等形态上的变化虽然趋势不一, 而彼此相互协调维系了根系的吸水功能进而提高对盐胁迫的适应性，但这种适应能力是有限的，随着盐浓度不断增加，根系质膜透性持续升高, 根系生长受到抑制, 根系吸收能力明显减弱。而这种情况不是一定在所有植物里都存在。Brock等在拟南芥中发现，即使在轻度盐胁迫下，拟南芥的根系都出现了较为明显生长抑制[15]。

(3)田间试验条件下，除平均直径外，其他根系形态均与盐浓度呈极显著的负相关。根总面积除与根总长度显著正相关外，与其他各根系形态指标均极显著正相关。这说明盐分对紫花苜蓿根系的生长有一定的抑制作用，且各根系形态指标的变化规律相一致。而在盆栽实验中，紫花苜蓿根系各形态指标的变化规律不是很一致，其原因可能在于盆栽试验中，紫花苜蓿相应盐胁迫的敏感性大大增加，规律性变化起伏大[13]。

(4)在轻度盐胁迫下，田间和盆栽苜蓿叶片Tr和WUE分别会下降和升高。这是由于Tr显著下降有利于减少地上部水分散失,在光合速率下降不显著的情况下，导致WUE在轻度盐胁迫下升高,而WUE的提高有利于干物质积累,且由于Na+进入植物体的量与Tr成比例,降低Tr可限制Na+进入叶片,相对减少了毒害离子(Na+)的吸收。因此,轻度盐胁迫下,苜蓿叶片Tr下降和WUE提高是一种适应性反应,既属于非盐生植物的避Na+机制,也是植物适应渗透胁迫的重要机制之一，但非盐生植物的这种适应能力是有限的,随着盐胁迫浓度的加大,植株水分失衡加剧,叶片膨压降低,叶片含水量进一步下降，光合能力持续下降,导致WUE降低。总之盐胁迫下,紫花苜蓿根系形态的改变是一种开源策略;而蒸腾耗水量的下降以及WUE的提高则是节流的一种表现。开源体现在盐胁迫下根系形态的适应性变化上，节流体现在盐逆境下捕获最大限度的水源并用最少量的水分消耗而获得最高的产量。

4结论

(1)低浓度盐胁迫下根系面积、总根长、根直径、根尖数的升高有利于提高根系吸水能力。

(2)叶片Tr 的下降和WUE 的升高有利于减少地上部水分散失, 补偿根系水分供应的不足,是苜蓿对渗透胁迫的适应性反应。

(3)随着盐胁迫浓度时间的加大,上述根系形态指标受抑制程度加大,根系吸收能力持续下降,同时Tr的进一步下降导致蒸腾拉力持续降低,水分失衡加剧，导致光合速率进一步降低,进而导致WUE降低,盐胁迫对植株的伤害加重。

(4)盐胁迫下，根系(地下部分)吸收能力的下降是导致水分(地上部分)失衡的主要原因,是决定苜蓿品种耐盐性的关键因素。

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(责任编辑邹永红)

Study on Morphological Structure Characteristics and Water Use Efficiency of Medicago Sativa under Different Salt Stress

GUO Peng, LI Lin-lin, JIN Hua, ZOU Ji-xiang, BAO Ya-jing

(School of Environment and Resources, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China)

Abstract:Through experimental studies on physiological characteristics of root system of alfalfa under the salt stress, we can really understand the salt tolerance of alfalfa. Delta-t scan software is used to scan the picture and analyze specific root morphological parameters including total root area, root length density, mean diameter and the number of root tips. 6400 photosynthetic apparatus was used to observe the stomatal conductance, net photosynthetic rate, transpiration rate and water use efficiency and measure different germination under salt stress in alfalfa. The results showed that changes of root morphology were different under different salt concentration. Mild salt stress can promote their growth, while the salinity increased it showed obvious inhibition. This experiment laid the foundation for screening salt tolerant alfalfa germplasm resources, and it has a profound significance to expand the utilization of alfalfa in saline alkali land.

Key words:salt stress; medicago sativa; transpiration rate (Tr); stomatal conductance (Gs); photosynthetic rate (Pn); water use efficiency (WUE)

收稿日期：2016-01-07；最后修回日期：2016-03-07

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31170168)；科技部火炬计划(2012GH531899)；国家星火计划资助项目(2013GA651006)；辽宁省科技计划项目(2011209001)；辽宁省高等学校优秀科技人才项目(LR2013055)。

作者简介：郭鹏(1980-)，男，山东胶州人，讲师，博士，主要从事植物生物抗逆学研究。

文章编号：2096-1383(2016)03-0193-05

中图分类号：S541.9

文献标志码：A