中国AML人群CEBPa、NPM1、FLT3-ITD基因突变发生率检测*

廖长风，刘礼平，赖文鸿，林传明，李海亮

(赣南医学院第一附属医院血液内科，江西　赣州　341000)



中国AML人群CEBPa、NPM1、FLT3-ITD基因突变发生率检测*

廖长风，刘礼平，赖文鸿，林传明，李海亮

(赣南医学院第一附属医院血液内科，江西赣州341000)

摘要：目的：回顾性分析大量病例的基因检测结果，阐述CEBPa、NPM1及FLT3-ITD这三种最常见的AML突变基因在中国人群中的发生率。方法：本研究总共从全国25家医院收集了878例AML成年患者的标本(包括骨髓和外周全血)的CEBPa、NPM1、FLT3-ITD基因突变检测的结果。结果：共检测出103例(11.7%)CEBPA基因突变，79例(9.0%)NPM1基因突变，以及71例(8.1%)FLT3-ITD基因突变阳性患者。在71例ITD基因突变阳性患者中，29例(40.8%)患者同时检测到NPM1基因突变阳性，12例(16.9%)患者同时有CEBPA基因突变。结论：本研究发现中国AML人群中CEBPA、NPM1和FLT3-ITD基因突变的发生率和国外文献报道的数据有所不同，为进一步探索其潜在原因提供了初步的数据依据。

关键词：突变基因；急性髓系白血病；发生率；中国

急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)是髓系原始细胞克隆性增生疾病，是造血前体细胞发生的一系列基因改变的结果。这些变化会引起造血细胞发生和分化的异常，从而导致大量不成熟的髓样细胞在骨髓和外周血中的出现和积累。这些异常细胞能够分裂和增殖，但不能分化成成熟的血细胞(即嗜中性粒细胞)。基因测序研究表明，原发性AML病例平均包含超过10个显著的基因突变。其中最常见的突变基因包括：FLT3(28%)，NPM1(27%)，DNMT3A(26%)，IDH1或IDH2(20%)，NRAS或KRAS基因(12%)，RUNX1(10%)，TET2(8%)，TP53(8%)，CEBPA(6%)和WT1(6%)。确定突变基因对判断AML患者的预后有相当的意义，并且影响治疗计划的选择[1]。本研究课题回顾性的分析了在878名AML患者中三种基因突变的发生情况，包括CEBPA (CCAAT enhancer-binding protein alpha)、NPM1 (Nucleophosmin)和FLT3-ITD(Fms-like tyrosine kinase 3-Internal tandem duplications)。

1材料和方法

1.1研究对象从2012年8月到2014年4月，我们回顾性研究了来自于全国25家医院急性髓系白血病(AML)成年患者的标本(包括骨髓和外周全血)的CEBPa、NPM1、FLT3-ITD基因突变检测的结果。AML的诊断依据血液病诊断与疗效标准第三版[2]。

1.2基因组 DNA 的制备取患者初诊时冻存的骨髓或外周血2～3 mL。采用DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司产品)提取基因组DNA，测定吸光度A260 nm/A280 nm值确定DNA产物的浓度，用去离子水稀释基因组DNA样品至50～150 ng·μL-1。

1.3PCR 扩增

1.3.1CEPBa基因扩增PCR 总体系 20 μL ，包括模板 DNA 3 μL、扩增反应液17 μL (上海源奇生物医药科技有限公司相关基因检测产品)。PCR条件：42 ℃ 5 min；94 ℃，5 min；(94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min)40个循环；72 ℃延伸5 min；产物4 ℃保持。反应液A的扩增片段大小在570 bp，反应液B的扩增片段大小在675 bp。

1.3.2FLT3-ITD和NPM1基因扩增PCR 总体系25 μL，包括模板DNA 3 μL、 扩增反应液22 μL(上海源奇生物医药科技有限公司相关基因检测产品)。PCR条件：42 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min (94 ℃ 15 s；60 ℃ 25 s；72 ℃ 1 min)40个循环；72 ℃延伸5 min；产物4 ℃保持。FLT3-ITD基因扩增片段大小450 bp，NPM1基因扩增片段大小250 bp。

1.4基因扩增产物序列分析使用测序产物纯化试剂及测序试剂(上海源奇生物医药科技有限公司产品)对扩增符合要求的PCR产物进行酶解、测序PCR及纯化。酶解PCR反应体系7 μL: PCR产物5 μL+2 μL SAP，混匀；PCR条件:37 ℃ 60 min;80 ℃ 15 min;产物 4 ℃存。测序PCR反应体系6 μL:PCR 酶解产物3 μL+1 μL测序剂(bigdye) +2 μL测序引物;PCR条件:96 ℃ 1 min(96 ℃ 10 s;50 ℃ 5 s;60 ℃ 4 min)30个循环;产物4 ℃保存。测序产物纯化采用标准的酒精/EDTA/NaAc法，用Applied Biosystems 3130测序仪(美国应用生物系统公司中国公司)通过毛细管电泳对纯化好的产物进行测序，运用Chromas软件分析测序结果。分别检测NPMl基因第12外显子基因的插入、FLT3-lTD基因第14和15号外显子基因的插入及CEBPa基因的插入缺失突变情况。

2结果

2.1一般资料本研究总共从全国25家医院收集了878例AML成年患者的标本(包括骨髓和外周全血)的CEBPA、NPM1、FLT3-ITD基因突变检测的结果。其中男性患者582名(66.3%)，女性患者296名(33.7%)。平均年龄64.1岁(20岁到79岁)。

2.2CEBPA、NPM1及FLT3-ITD基因突变测序的结果878例AML病例中，共检测出103例(11.7%)CEBPA基因突变阳性患者，79例(9.0%)NPM1基因突变阳性患者，71例(8.1%)FLT3-ITD基因突变阳性患者。在71例ITD基因突变阳性患者中，29例(40.8%)患者同时检测到NPM1基因突变阳性，12例(16.9%)患者同时有CEBPA基因突变。有两个基因突变阳性的患者占到总患者人群的4.7%(41例)见图1。

箭头所示为突变发生的位点。

3讨论

FLT3是一种跨膜的络氨酸酶受体，它的激活会刺激细胞的增殖。FLT3基因突变已经被公认为AML中发生率最高的一种基因改变，其中最常见的突变为内部串联复制 (FLT3-ITD)。FLT3-ITD的突变以及其导致的FLT3受体络氨酸激酶的激活在AML患者中非常常见，特别是在正常核型的患者中[3]。FLT3-ITD 为FLT3突变的主要表现形式，国外报道FLT3-ITD在 AML 中的发生率约为 20%[3-5]，而在 AML-NK 中突变频率为 28%～34%[6]。本研究AML患者中FLT3-ITD检测的突变率为8.1%，低于国内其他报道[7]，可能本研究样本来自于多地区中心人群相关，各地区样本量的不均一可能会导致检测出的突变率有差异，更大样本量及分区域的数据分析能协助了解区域性差异。FLT3-ITD的突变和儿童和年轻AML患者的较差的预后有直接相关，同时与接收高密度化疗的老年患者的较差的预后也密切相关[8-12]。Marcucci和Schlenk的研究分别发现，FLT3-ITD的AML患者，其2年无病生存率和4年总体生存率均为20%[9，13]。

核仁磷酸蛋白 (Nucleophosmin gene) NPM1 是一种广泛表达的磷蛋白，通常穿梭于细胞核和胞质之间，参与核糖体蛋白的组装、转运，以及肿瘤抑制基因ARF的调控[14]。NPM1基因位于第5号染色体 q35[14]，其基因突变是急性髓系白血病的一种特异性表现，其发生率在正常核型的成人急性髓系白血病(AML-NK)患者中约为50%～60%[15]。NPM1基因突变通常与更好的AML预后相关[16]。 伴有NPM1基因突变的患者对化疗药物诱导的缓解敏感，因此Schnittger等提出可以将NPM1突变阳性作为预测AML的预后良好的指标之一[17]。

CEBPA基因编码CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding protein alpha)，一种粒细胞分化因子，是转录因子家族中的重要成员，在髓系分化中起着重要作用[18-19]。CEBPA在AML中的发生比例约为5%～14%[20]。本研究检测的AML人群中CEBPA突变的发生为11.7%，与先前的中国人群研究一致[21-22]。CEPBA突变可分为2种形式：(1)C-端发生突变对基本区域进行干扰，进而影响DNA结合。该突变形式存在于大多数AML患者中；(2)N-端突变，由于不能形成完整的42 KD蛋白质，因此引发细胞增殖[23]。目前研究表明，CEBPA 基因突变可以作为一个独立的预后良好的指标[23]，在AML的患者中，与CEBPA没有突变的患者相比， CEBPA突变的患者总生存期较长[20，24]。还有研究表明，若有两种基因同时发生突变，对AML患者的预后将会发生较大的影响[24]。

在本研究中，我们在AML患者中共检测出4.7%的病例(41例)有两个基因的突变，其中包括29名患者同时检测到FLT3-ITD和NPM1基因突变阳性，以及12例患者同时有FLT3-ITD和CEBPA基因突变。NPM1 突变经常同FLT3-ITD突变一起发生，很少伴随其他突变发生，并且NPM1+/FLT3-ITD患者的预后良好，提示NPM1+是NK-AML患者独立的良好预后因素[25]。但研究表明，伴有FLT3-ITD阳性的患者 NPM1突变不能改变其不良的预后[26]。而CEBPA突变患者往往同时存在FLT3-ITD突变[24]，FLT3-ITD突变能够降低患者的总生存期，因此单纯CEBPA突变的AML患者预后较好，若同时伴随FLT3-ITD突变，将会影响AML患者对化疗药物诱导的缓解效果，预后仍然不佳[26]。

本回顾性研究对多中心和大量病例的基因检测结果进行了分析，阐述了CEBPA、NPM1及FLT3-ITD这三种最常见的AML突变基因在中国人群中的发生率。

参考文献:

[1]Santamaria, CM,Chillón MC,García-Sanz R,et al.Molecular stratification model for prognosis in cytogenetically normal acute myeloid leukemia[J]. Blood,2009,114(1):148-152.

[2]张之南，沈悌.血液病诊断与疗效标准[M].第3版.北京：科学出版社，2007.

[3]Artz A,Dong X.Defining anemia by race using epidemiologic data[J]. Blood,2008,111(5):2941.

[4]Kottaridis PD,Gale RE,Frew ME,et al.The presence of a FLT3 internal tandem duplication in patients with acute myeloid leukemia (AML) adds important prognostic information to cytogenetic risk group and response to the first cycle of chemotherapy: analysis of 854 patients from the United Kingdom Medical Research Council AML 10 and 12 trials[J].Blood,2001,98(6):1752-1759.

[5]Meshinchi S,Alonzo TA,Stirewalt DL,et al.Clinical implications of FLT3 mutations in pediatric AML[J].Blood,2006，108(12):3654-3661.

[6]Santos FP,Jones D,Qiao W,et al.Prognostic value of FLT3 mutations among different cytogenetic subgroups in acute myeloid leukemia[J].Cancer,2011，117(10):2145-2155.

[7]王莉红,周春林,张新伟,等.FLT3基因内部串联重复突变与急性白血病的关系及临床意义[J]. 中华血液学杂志, 2004，25(7):393-396.

[8]Kottaridis PD,Gale RE,Linch DC.Flt3 mutations and leukaemia[J].Br J Haematol,2003，122(4):523-538.

[9]Marcucci G,Maharry K,Whitman SP,et al.High expression levels of the ETS-related gene, ERG, predict adverse outcome and improve molecular risk-based classification of cytogenetically normal acute myeloid leukemia: a Cancer and Leukemia Group B Study[J].J Clin Oncol, 2007，25(22):3337-3343.

[10]Patel JP,Gönen M,Figueroa ME,et al.Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia[J].N Engl J Med,2012，366(12):1079-1089.

[11]Rockova V,Abbas S,Wouters BJ,et al.Risk stratification of intermediate-risk acute myeloid leukemia:integrative analysis of a multitude of gene mutation and gene expression markers[J].Blood,2011，118(4):1069-1076.

[12]Schnittger S,Schoch C,Dugas M,et al.Analysis of FLT3 length mutations in 1003 patients with acute myeloid leukemia:correlation to cytogenetics,FAB subtype,and prognosis in the AMLCG study and usefulness as a marker for the detection of minimal residual disease[J].Blood,2002，100(1):59-66.

[13]Schlenk RF,Döhner K,Krauter J,et al.Mutations and treatment outcome in cytogenetically normal acute myeloid leukemia[J].N Engl J Med,2008，358(18):1909-1918.

[14]Grisendi S,Mecucci C,Falini B,et al.Nucleophosmin and cancer[J].Nat Rev Cancer,2006，6(7):493-505.

[15]Falini B,Mecucci C,Tiacci E,et al.Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype[J].N Engl J Med,2005，352(3):254-266.

[16]Sekeres MA,Peterson B,Dodge RK,et al.Differences in prognostic factors and outcomes in African Americans and whites with acute myeloid leukemia[J].Blood,2004， 103(11):4036-4042.

[17]Schnittger S,Schoch C,Kern W,et al.Nucleophosmin gene mutations are predictors of favorable prognosis in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype[J].Blood,2005，106(12):3733-3739.

[18]Owen C,Barnett M,Fitzgibbon J.Familial myelodysplasia and acute myeloid leukaemia—a review[J].Br J Haematol,2008，140(2):123-132.

[19]Smith ML,Cavenagh JD,Lister TA,et al.Mutation of CEBPA in familial acute myeloid leukemia[J].N Engl J Med,2004，351(23):2403-2407.

[20]Marcucci G,Maharry K,Radmacher MD,et al.Prognostic significance of, and gene and microRNA expression signatures associated with, CEBPA mutations in cytogenetically normal acute myeloid leukemia with high-risk molecular features: a Cancer and Leukemia Group B Study[J].J Clin Oncol,2008，26(31):5078-5087.

[21]王芳,张阳，陈雪，等.初诊急性髓系白血病患者十种常见突变基因的突变组分析[J].白血病·淋巴瘤,2015，24(3)：161-164.

[22]韩聪, 林冬,艾晓非.急性髓系白血病CEBPA基因突变分析[J].中华血液学杂志, 2013，34(7)：566-571.

[23]Caligiuri MA,Strout MP,Lawrence D,et al.Rearrangement of ALL1 (MLL) in acute myeloid leukemia with normal cytogenetics[J].Cancer Res,1998，58(1):55-59.

[24]Preudhomme C,Sagot C,Boissel N,et al.Favorable prognostic significance of CEBPA mutations in patients with de novo acute myeloid leukemia:a study from the Acute Leukemia French Association (ALFA)[J].Blood,2002，100(8):2717-2723.

[25]Döhner K, Schlenk RF,Habdank M,et al.Mutant nucleophosmin (NPM1) predicts favorable prognosis in younger adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics: interaction with other gene mutations[J].Blood,2005，106(12):3740-3746.

[26]Gale RE,Green C,Allen C,et al.The impact of FLT3 internal tandem duplication mutant level, number,size, and interaction with NPM1 mutations in a large cohort of young adult patients with acute myeloid leukemia[J]. Blood,2008，11(5):2776-2784.

Detection of Gene Mutation Rate of CEBPa, NPM1 and FLT3-ITD in Patients with Acute Myeloid Leukemia in China

LIAOChang-feng,LIULi-ping,LAIWen-hong,LINChuan-ming,LIHai-liang

(Dept.ofInternalMedicineofHematology,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Abstract:Objective:To analyze retrospectively the results of gene detection in a large number of cases and to describe the incidence of gene mutation of CEBPa, NPM1 and FLT3-ITD, three most common AML mutations, in the Chinese population. Methods:CEBPa,PM1,FLT3-ITD mutation detection in adult patients of 878 cases with AML were collected from 25 hospitals.Results:103 cases (11.7%) of CEBPA mutations,79 cases (9%) of NPM1 mutations, and 71 cases (8.1%) of FLT3-ITD mutation were detected to be positive. In the 71 positive ITD mutation patients, 29(40.8%) patients were simultaneously detected NPM1 mutation, and 12 patients (16.9%) had CEBPA mutation simultaneously. Conclusion:This study found CEBPA, NPM1, FLT3 gene mutation in Chinese AML population occurrence rate vary from the data reported in foreign literature. This provides preliminary data for further exploration of the underlying cause.

Key words:mutation gene;acute myeloid leukemia;incidence;China

*基金项目：江西省卫生计生委科技计划资助项目(编号：20155410)

通讯作者：李海亮，男，学士，主任医师，从事血液病研究。E-mail:gyfylhl@163.com

中图分类号：Q754

文献标志码：A

文章编号：1001-5779(2016)02-0208-04

DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2016.02.013

(收稿日期：2015-07-15)(责任编辑：敖慧斌)