赣南黄花倒水莲水提取物体外清除超氧阴离子活性的实验研究*

李洪亮,程齐来,刘　涛,范小娜

(赣南医学院,江西　赣州　341000)



赣南黄花倒水莲水提取物体外清除超氧阴离子活性的实验研究*

李洪亮,程齐来,刘涛,范小娜

(赣南医学院,江西赣州341000)

摘要：目的：评价黄花倒水莲水提取物体外清除超氧阴离子能力，探讨黄花倒水莲水提取物降低超氧阴离子对细胞DNA的损伤。方法：基于邻苯三酚在碱性条件下不稳定，自氧化产生(O2.-)，O2.-与化学发光剂鲁米诺(Luminol)反应使之氧化，产生一个电子激发态的中间体，退激时发光的原理，检测黄花倒水莲水提取物体外清除超氧阴离子的能力。结果：在黄花倒水莲水提取物的原浓度(3 000.000 mg·mL-1)时，超氧阴离子被清除了90.451%，随着黄花倒水莲水提取物溶液的稀释，其清除超氧阴离子的能力逐渐降低，当稀释为原浓度的1/128(23.438 mg·mL-1)时，黄花倒水莲水提取物溶液清除超氧阴离子的能力与空白组比较接近。结论：黄花倒水莲水提取物具有良好的体外清除超氧阴离子活性的能力，随着黄花倒水莲水提取物溶液的稀释，其清除超氧阴离子的能力逐渐降低。

关键词：黄花倒水莲水提取物；超氧阴离子；邻苯三酚

超氧阴离子在人体内有一定数量的存在，不发生化学变化对人体无害，但与羟基(-OH)结合后的产物会导致细胞DNA损坏，破坏人类机体功能[1]。消除超氧阴离子的方法，目前挥发油抑制超氧阴离子的产生并清除其活性，可降低超氧阴离子对细胞DNA的损伤，黄花倒水莲(PolygalafallaxHemsl,PFH)又称假黄花远志，主产于湖南、广西、江西、广东和云南等地，药用其全草。味甘、微苦、性平、具有补益、强壮、祛湿、散癖功效，主治虚弱虚肿、急慢性肝炎、腰腿酸痛、跌打损伤[2]。随着现代社会生活节奏的加快，人们承受社会、心理、工作的压力越来越大，导致胃黏膜疾病的发生率相应增高。中医临床研究发现，在胃黏膜疾病患者中有脾胃虚弱证者占相当的比重，本课题组研究发现黄花倒水莲和六月雪二味中药煎剂是以疏肝健脾为法，以民间二味中药复方煎剂治疗上消化道出血为依据，对治疗腹泻型肠易激综合征具有明显的效果，对小鼠胃黏膜损伤有明显的保护作用，因此我们针对黄花倒水莲水提取物体外抗超氧阴离子活性，探讨黄花倒水莲水提取物降低超氧阴离子对细胞DNA的损伤，现报道如下。

1材料与方法

1.1仪器与试剂BPCL-1-G-C微弱发光测量仪 (中国科学院北京生物物理研究所)；邻苯三酚(江西洪都化学制剂厂)；3-氨基邻苯二甲酰肼(luminol)(Sigma公司)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(上海化学试剂总厂)； 其他试剂均为分析纯。

1.2样品溶液的制备取干燥六月雪1 500 g,加双蒸水过液面2 cm,煮沸2次，30 min·次-1，合并滤液，浓缩至400 mL加3倍量的95%乙醇，放冰箱静置过夜，次日减压过滤，并回收滤液中乙醇，继续浓缩滤液得无醇味的提取物。提取物加双蒸水至500 mL使药液为相当于生药复方3 g·mL-1，用0.5%NaOH调整pH为7.0置冰箱中备用。

1.3清除超氧阴离子(O2.-)实验

1.3.1试液配制本实验采用邻苯三酚-鲁米诺-碳酸缓冲液(pH 10.2)体系，邻苯三酚溶液：0.126 g邻苯三酚加入7.74 mg EDTA，加1 mmol·L-1HCl水溶液溶解，定容到100 mL，4 ℃保存，临用前用蒸馏水稀释10倍。碳酸缓冲液(pH 10.2)：0.1 mol·L-1碳酸钠水溶液210 mL和0.1 mol·L-1碳酸氢钠水溶液90 mL混合，加入111.6 mg EDTA，溶解，调至pH=10.2即得。鲁米诺溶液：17.7 mg鲁米诺加入0.1 mol·L-1碳酸钠水溶液定溶到100 mL，4 ℃保存，临用前与碳酸缓冲液(pH 10.2)以(1∶2)混匀。

1.3.2超氧阴离子的产生与清除实验原理及方法邻苯三酚在碱性条件下不稳定，自氧化产生(O2.-)，O2.-与化学发光剂鲁米诺(Luminol)反应使之氧化，产生一个电子激发态的中间体，退激时发光。抗氧化剂可以清除O2.-，抗氧化剂与O2.-反应的原理是使O2.-质子化，从而使O2.-被还原，因此可以减少激发态鲁米诺的产生，所以发光强度降低。操作步骤为：在发光杯中加入10 μL黄花倒水莲水提取物溶液(以相同量的蒸馏水作空白对照)和20 μL邻苯三酚溶液，再加入鲁米诺-碳酸缓冲液(1∶2)混合溶液970 μL启动反应，记录发光强度(Chemical Luminescence，CL)。CL值以峰高计算，根据CL大小可以判断物质清除自由基的能力。自由基清除率用以下公式计算。

自由基清除率=(CL空白对照-CL样品)/CL空白对照×100%

邻苯三酚-鲁米诺-碳酸缓冲液(pH 10.2)发光体系的动力曲线见图1。从该动力曲线图可见，反应在启动后，将在200秒钟之内出现最高峰，在300秒之后发光基本结束。

图1　邻苯三酚-鲁米诺-碳酸缓冲液(pH 10.2)体系动态曲线

该体系的工作原理如下：

①邻苯三酚在碱性环境下自氧化产生超氧阴离子(O2.-)。

②超氧阴离子(O2.-)夺取还原剂的一个氢而被还原。

③剩余的超氧阴离子(O2.-)将鲁米诺氧化为电子激发态，退激发时释放一个光子。

以高浓度逐渐稀释的方式检测不同浓度黄花倒水莲水提取物对CL的影响，每个浓度黄花倒水莲水提取物都做相应的空白对照。根据以上公式计算对自由基的清除率，建立量效关系曲线，通过量效曲线求算出发光抑制率为50%时黄花倒水莲水提取物的浓度(IC50)值，IC50值反映了黄花倒水莲水提取物对自由基的清除能力。IC50值越小，表明黄花倒水莲水提取物清除自由基的能力越强。

2结果

根据表1的结果计算，黄花倒水莲水提取物对超氧阴离子的IC50=444.113 mg·mL-1。由抑制曲线图(图2)可以看到，在黄花倒水莲水提取物的原浓度(3 000.000 mg·mL-1)时，超氧阴离子被清除了90.451%，随着黄花倒水莲水提取物的稀释，其清除超氧阴离子的能力逐渐降低，当稀释为原浓度的1/128(23.438 mg·mL-1)时，黄花倒水莲水提取物清除超氧阴离子的能力与空白组比较接近。各曲线达峰时间基本相同，说明黄花倒水莲水提取物对超氧阴离子的产生并没有明显影响，主要的作用环节为清除已生成的超氧阴离子。

表1　黄花倒水莲水提取物对超氧阴离子的抑制率

图2　黄花倒水莲水提取物对超氧阴离子体系动态曲线

3讨论

血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)产生超氧阴离子，超氧阴离子自由基O2·-是生物体内一类重要的氧自由基，可以经过一系列反应生成其它自由基，从而引发一系列疾病比如：应激性胃炎、应激性结肠炎都与自由基对组织的破坏有关，及时清除过剩的O2.-具有重要意义，天然SOD目前认为是最好的抗氧化物质，但普遍存在稳定性差，分子量大，不容易透过细胞膜，且有免疫原性等缺点，使其应用受到限制[3]。因此寻找天然的抗氧化药物是目前的研究热点，有学者伺机从动物体内获得天然的抗氧化药物，采用碱性蛋白酶酶解鲽鱼鱼皮胶原蛋白制备胶原蛋白肽，对其清除超氧阴离子自由基的能力进行研究，发现胶原蛋白肽有良好的清除超氧阴离子自由基的能力[4-5]，有研究认为中药薏苡仁饮料的抗氧化活性，通过测定饮料清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和超氧阴离子自由基(O2.-)的能力对薏苡仁饮料的抗氧化能力进行评价，发现薏苡仁饮料中的抗氧化物质具有一定的抗氧化活性[6]，还有研究认为石榴皮鞣质对羟自由基和超氧阴离子自由基均具有较好的清除作用，较低浓度时即可发挥清除作用[7]。

有学者对广西黄花倒水莲的抗氧化活性及有效部位进行研究，分离得到7个化学性质不同的组分用比色法研究了各组分还原三价铁离子及清除脂性自由基DPPH能力，采用化学发光法观察各组分清除羟自由基和超氧阴离子的活性，发现广西黄花倒水莲各组分均有一定的清除自由基作用，这可以用来解释其在传统应用中的抗炎、抗衰老作用。最近本课题组对赣南中草药进行大面积普查，同时对赣南黄花倒水莲开花周期，以及生长环境进行摸查，发现赣南黄花倒水莲资源短缺，并且由于大量采摘导致花粉受精周期延长，为了充分利用资源，本课题组对赣南黄花倒水莲药理作用进行梳理，黄花倒水莲水提物对乙醇损伤的人胃黏膜上皮细胞具有保护作用，为探讨其具体机制我们利用黄花倒水莲水提取物对超氧阴离子的抑制作用，降低超氧阴离子对细胞DNA的损伤，实验结果可以看到，在黄花倒水莲水提取物的原浓度(3 000.000 mg·mL-1)时，超氧阴离子被清除了90.451%，随着黄花倒水莲水提取物的稀释，其清除超氧阴离子的能力逐渐降低，

当稀释为原浓度的1/128(23.438 mg·mL-1)时，黄花倒水莲水提取物清除超氧阴离子的能力与空白组比较接近。各曲线达峰时间基本相同，说明黄花倒水莲水提取物对超氧阴离子的产生并没有明显影响，主要的作用环节为清除已生成的超氧阴离子，实验结果表明赣南黄花倒水莲水提取物也具有良好的抗氧化活性，但其抗氧化活性与其对胃黏膜损伤的保护是否有一定的联系还需要大量的实验证明。

参考文献：

[1]何秀英，吴纪梅，严振寰．邻甲氧基苯甲醛丙氨酸席夫碱及其金属配合物的合成、表征和对O2自由基的抑制作用[J].无机化学学报，1995(3)：302.

[2]王群，郑海涛，葛尧，等．酶法制备鲽鱼鱼皮胶原蛋白肽及其清除超氧阴离子自由基的研究[J].中国农学通报，2011,27(14)：302.

[3]陈健，黄媛恒，王乃平，等．玉郎伞多糖和皂苷对氧自由基清除作用研究[J].中药药理与临床，2007，5(5)：100-102.

[4]盘赛昆，顾小红，汤坚，等．鳙鱼肉酶解物清除羟自由基的研究[J].食品与机械，2009，25(4)：65-67.

[5]袁晓晴，戴志远，叶婧．响应面法优化鳙鱼鱼肉蛋白的酶解工艺[J].安徽农业科学，2010，38(21)：11499-11502.

[6]杜云建，赵玉巧，李念念．酶解法制备草鱼鱼鳞多肽及其清除羟自由基的研究[J]. 食品科学，2010，31(7)：168-172.

[7]侯付景，金春华，董明敏，等．响应面分析法优化海地瓜酶解工艺及其抗氧化活性的研究[J].营养学报，2010，32(3)：276-280.

Experimental Study on Scavenging Superoxide Anion Activity of Water Extract of Polygala Fallax Hemsl in Vitro

LIHong-liang,CHENQi-lai,LIUTao,FANXiao-na

(GannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Abstract:Objective: To evaluate the ability of Polygala fallax Hemsl water extract to scaveng superoxide anion in vitro; to explore the damage of Polygala fallax Hemsl water extract by lowering superoxide anion on cell DNA. Methods: Based on the principle that when in alkaline condition pyrogallol is not stable,, the self-oxidation produces (O2.-), O2.-and chemical Luminol (Luminol) of oxidation reaction, and to produce an electronic excited state of intermediatesand luminous deexcitation , the ability of Polygala fallax Hemslwater extract used to remove superoxide anion in vitro was detected. Results: In the Polygala fallax Hemsl water extract of the original concentration (3 000.000 mg·mL-1), the ultra oxygen anion was removed by 90.451%. With the dilution of the water extract its ability to remove the ultra oxygen anion reduced gradually. when diluted to 1/128 of the original concentration (23.438 mg·mL-1), the ability of Polygala fallax Hemsl water extract solution to remove the ultra oxygen anion was closed to the blank group. Conclusion: Polygala fallax Hemsl water extract has a good ability to remove super oxide anion activity in vitro. With the dilution of Polygala fallax Hemsl water extract solution, its ability to remove superoxide anion decreases gradually.

Key word:Polygala fallax Hemsl water extract;superoxide anion;pyrogallic acid

*基金项目：江西省自然科学基金项目(20132BAB205078)；江西省教育厅科技项目(GJJ13680)

通讯作者：范小娜，女，教授，硕士生导师，主要从事中草药活性成分筛选及新药研发。E-mail:fxn918@126.com

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1001-5779(2016)02-0176-04

DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2016.02.003

(收稿日期：2015-10-22)(责任编辑：敖慧斌)