茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶机理研究

程水明，雷霄宇，刘冰洁，刘莹，王益，黄文，*（.广东石油化工学院环境与生物工程学院，广东茂名55000；.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070）



茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶机理研究

程水明1，雷霄宇2，刘冰洁2，刘莹2，王益2，黄文2，*
（1.广东石油化工学院环境与生物工程学院，广东茂名525000；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070）

摘要：为明确茯苓皮中天然的三萜化合物抑制酪氨酸酶的保健功效，增强茯苓皮在生产加工中的应用，提高其附加价值，采用体外生化酶学法研究茯苓皮三萜化合物对酪氨酸酶活性的抑制作用，初步探究茯苓皮三萜对酪氨酸酶的抑制的机理。结果表明氯仿萃取物对酪氨酸酶的抑制效果最好，氯仿是良好的萃取剂；茯苓皮三萜对酪氨酸酶的抑制属于不可逆抑制。

关键词：茯苓皮；三萜；酪氨酸酶；抑制率

茯苓［Poria cocos（Schw.）Wolf，茯苓的干燥菌核］，所属多孔菌科真菌类，茯苓皮是在加工茯苓菌核时剥下的干燥表皮，呈不规则的片状，体软质松，略有弹性，外表面是棕色或深至黑褐色，有瘤状突起物；内表面是白色至淡棕色，皮下部分常常有淡红色［1］。在《四川中药志》中，有关于茯苓皮的记载，称其“性平，味甘淡，无毒”，并能“入肾、膀胱二经”［2］。《医林篡要》中称茯苓皮为“行皮肤之水”。《本草纲目》中有关茯苓皮的记载称其“主水肿肤胀，能开水道，开腠理”［3］。并且与茯苓相比，茯苓皮在利水消肿的方面，其效果更是优于茯苓［4］。

目前，经常使用的酪氨酸酶活性抑制剂主要分为：化学合成物、微生物源材料和植物天然活性物质［5］。但是由于化学合成物和微生物源材料具有毒性或稳定性差等缺点，制约了其在实际应用中的发展，而天然活性物质对皮肤的刺激性小、且渗透性好、安全性高，因此具有抑制酪氨酸酶作用的天然活性成分越来越受到关注，有良好的研究价值。茯苓皮中的三萜类化合物作为天然活性物质具有多种生理活性［6-7］，但在抑制酪氨酸酶机理方面的研究却比较少。

本文研究了茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶酶活的活性及其产生作用的机制，旨在探讨茯苓皮三萜的抑制酪氨酸酶的保健功效，为茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶机理的研究提供理论基础和科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

原料及预处理：试验中所用到的茯苓皮由湖北省九资河镇提供，将茯苓皮风干，用多功能粉碎机进行粉碎后过40目筛，防潮备用。

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、VC、二甲亚砜（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；L-酪氨酸（生化试剂）：上海康达氨基酸厂。

1.2仪器与设备

722型可见分光光度计：上海新茂仪器有限公司；HH数显恒温水浴锅：江苏金坛市金城国盛实验仪器厂；AL203电子天平、Seven Easy pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；RE-2000 A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器有限公司；Apha2-4 LD冷冻干燥机：德国GHRIST公司。

1.3方法

1.3.1茯苓三萜的提取［8］

1.3.1.1茯苓皮中三萜化合物的提取

用溶剂浸提法对茯苓皮浸提，准确称量茯苓皮粉20g（过40目筛），萃取溶剂为甲醇，料液比为1∶20（g/mL），在70℃下水浴回流6 h，同样条件下提取2次。每次提取后回收提取液，趁热过滤，旋转蒸发，低温烘干或真空冷冻干燥，得到三萜粗提物干燥粉末。

1.3.1.2茯苓皮三萜的萃取

准确称取茯苓皮三萜粗提取物干燥粉末，混散于一定体积的蒸馏水中，分别用3倍剂量的萃取剂氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，直到萃取液为无色为止。经旋转蒸发，低温烘干或真空冷冻干燥，得到3种萃取物粉末。

1.3.2茯苓皮提取物三萜含量的测定［9］

1.3.2.1熊果酸标准曲线的制作

称取熊果酸标准品2.5 mg溶于甲醇溶液并定容至50 mL，配制成0.05 mg/mL标准液。分别量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL标准液，70℃条件下蒸干溶剂，之后的反应条件参考易中宏等［9］所优选出的条件进行试验。最终在546 nm处测吸光值。由熊果酸标准曲线可求得回归方程为：y = 0.064 2x- 0.010 4，其中R2= 0.99907。

1.3.2.2茯苓皮粗提取物和萃取物三萜含量的测定

准备却称取茯苓皮三萜粗提取物和萃取物0.01 g，溶于100 mL甲醇溶液。量取2 mL该稀释液，70℃条件下蒸干溶剂，之后的反应条件参考易中宏等［9］所优选出的条件进行试验。最终在546 nm处测吸光值。

1.3.3样品液的制备

分别精确称取茯苓皮三萜粗提取物，用二甲亚砜溶解，依次配成1、3、5、7、9 mg/mL浓度梯度的样品液备用。

分别精确称取茯苓皮三萜氯仿、乙酸乙酯、正丁醇3种萃取物，分别用二甲亚砜溶解，依次配成1、3、 5、7、9 mg/mL浓度梯度的样品液备用。

精确称取VC，用蒸馏水溶解，依次配成1、3、5、7、9 mg/mL浓度梯度的样品液备用。

1.3.4不同浓度抑制剂对酪氨酸酶活性的抑制［10-11］

酪氨酸酶活性抑制试验利用L-酪氨酸作为底物进行催化反应，用比色法于475 nm处测定吸光度变化。经过前期试验优化结果选择抑制反应试验条件为：反应的温度37℃，水浴恒温时间10 min，反应pH 6.8，反应时间10min，加入的L-酪氨酸的浓度为0.6 mmol/mL，酶液的量为1.0 mL（97 IU/mL）。反应中不同浓度样品、二甲亚砜（DMSO）、磷酸缓冲液（PBS）、酪氨酸酶液、及L-酪氨酸的添加量如表1所示。

表1　各反应成分的添加量Table 1 The additive content of different component

酪氨酸酶酶活的抑制率计算公式：

1.3.5茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶酶学机理研究［12-13］

1.3.5.1茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶酶活的机理

在5 mL磷酸缓冲液（pH 6.8）酶活测定体系中，固定底物L-酪氨酸的浓度，改变加入的酪氨酸酶的量，测定不同浓度（1、3、5 mg/mL）茯苓皮三萜粗提物对酶催化L-酪氨酸氧化活力的影响，并用作图法鉴别，用反应速度对酶浓度作图，如果作图结果为一组直线且通过原点，则为可逆抑制；如果得到一组平行直线，则为不可逆抑制。

1.3.5.2抑制剂对酶的活力的反应进程

以0.6 mmol/mL的L-酪氨酸为底物，测定茯苓皮三萜作为抑制剂对酪氨酸酶活力作用的影响。在5 mL的磷酸缓冲液（pH 6.8）体系中，加入1.0 mL L-酪氨酸溶液，3 mL磷酸缓冲液以及0.5 mL不同浓度的茯苓皮三萜溶液，37℃水浴10 min后加入1 mL酪氨酸酶。混匀后，在37℃恒温的条件下测定样品的吸光度随时间变化的增长变化曲线，从而得到反应进程。

2　结果与分析

2.1茯苓皮粗提取物和萃取物三萜含量测定

茯苓皮粗提取物和萃取物三萜含量测定见表2。

表2　各种样品中的三萜含量Table 2 The triterpenoids content of various samples

2.2抑制剂对酪氨酸酶的抑制作用

2.2.1不同浓度茯苓皮三萜粗提取物对酪氨酸酶的抑制作用

不同浓度的茯苓皮三萜粗提物对酪氨酸酶的抑制作用见图1。

图1　不同浓度茯苓皮三萜粗提取物对酪氨酸酶活性抑制作用Fig.1 The inhibition of different concentrations of crude extracts of Poria peel triterpenoids on tyrosinase activity

由图1可知，茯苓皮三萜粗提取物对酪氨酸酶的抑制率与三萜的浓度有一定的相关性。抑制率先随着样品浓度的增大而增大，直至达到最大值，而后随着样品浓度的增大而快速降低，当样品浓度达到最大值9 mg/mL时，茯苓皮三萜提取物的抑制率降到最低点。茯苓皮三萜粗提取物浓度在5 mg/mL时对酪氨酸酶的抑制率达到最大值，抑制率可达43.4%。

对一些天然产物的活性研究发现，有部分天然产物对酪氨酸酶的抑制具有双向作用［14-15］。本试验中，茯苓皮三萜化合物对酪氨酸酶的抑制率呈现先上升后下降的趋势，原因可能是由于抑制剂的量增加会增强其对酪氨酸酶的抑制效果，同时茯苓皮三萜化合对酪氨酸酶的抑制也具有双向作用，所以抑制率曲线会出现一定的波动，抑制率有所下降，但是由于试验中三萜样品的浓度为达到文献中所报道的激活酪氨酸酶的浓度，试验结果只是表现出了一定的波动性，而并没有显示出其对酪氨酸酶的激活效果。

VC是目前公认的酪氨酸酶抑制剂，因此本试验选择用VC做为茯苓皮三萜抑制作用的阳性对照。茯苓皮三萜提取物的抑制率与阳性对照品VC相比，茯苓皮三萜粗提取物在中间浓度5 mg/mL时，对酪氨酸酶的抑制效果明显好于VC，在此浓度下，茯苓皮三萜对酶的抑制率比VC的抑制率高6%。在3 mg/mL时，茯苓皮三萜粗提取物对酪氨酸酶的抑制率也稍稍高于VC。而在其他浓度时，VC对酪氨酸酶的抑制效果均好于茯苓皮三萜粗提取物的抑制效果。

2.2.2不同浓度茯苓皮三萜氯仿萃取物对酪氨酸酶的抑制作用

不同浓度的茯苓皮三萜氯仿萃取物对酪氨酸酶活性抑制作用见图2。

图2　不同浓度茯苓皮三萜氯仿萃取物对酪氨酸酶活性抑制作用Fig.2 The inhibition of different concentrations of chloroform extract of Poria peel triterpenoids on tyrosinase activity

由图2可知，茯苓皮三萜氯仿萃取物对酪氨酸酶的抑制率会随着其浓度的变化而改变，呈先增大后减小的趋势。氯仿萃取物对酶的抑制率在较低浓度时就能达到最大值，即3 mg/mL时达到最大抑制率52.6%。之后随着样品浓度的增大抑制效果降低，最低抑制率为22.8%。从总体来看，氯仿萃取物对酪氨酸酶的抑制率均比较高，尤其是在低浓度的范围内，其抑制率就能达到44%以上，在较高浓度范围内，抑制率虽有下降，但是仍然保持相对较高的抑制率。

氯仿萃取物对酶的抑制率在较低浓度范围内就能达到最大值，分析原因可能是由于氯仿萃取物中三萜的含量较高，其含量为56.51%，明显高于茯苓皮三萜粗提取物和其他两种萃取物中的三萜含量，因此能在相对较低的浓度时达到最大抑制率。氯仿萃取物3 mg/mL～9 mg/mL浓度范围内对酪氨酸酶抑制率会有所下降，可能是由于抑制剂量过多，与酪氨酸酶竞争性结合导致抑制剂之间相互干扰影响抑制效果［16］。

茯苓皮三萜氯仿萃取物的抑制率与阳性对照品VC相比，茯苓皮三萜氯仿萃取物在1 mg/mL至5 mg/mL的浓度范围内，其对酪氨酸酶的抑制效果均明显好于VC。在5 mg/mL之后，抑制率逐渐降低，浓度高于7 mg/mL时，VC对酪氨酸酶的抑制效果好于茯苓皮三萜提取物的抑制效果。

2.2.3不同浓度茯苓皮三萜乙酸乙酯萃取物对酪氨酸酶的抑制作用

不同浓度的茯苓皮三萜乙酸乙酯萃取物对酪氨酸酶活性抑制作用见图3。

图3　不同浓度茯苓皮三萜乙酸乙酯萃取物对酪氨酸酶活性抑制作用Fig.3 The inhibition of different concentrations of ethylacetate extract of Poria peel triterpenoids on tyrosinase activity

由图3可知，茯苓皮三萜乙酸乙酯萃取物在1mg/mL 至9 mg/mL的浓度范围内，对酪氨酸酶的抑制作用呈先下降后上升，达到最高点之后又逐渐下降的趋势。图3显示，在3 mg/mL时，乙酸乙酯萃取物对酪氨酸酶的抑制率低于1 mg/mL时的抑制率；并且在5 mg/mL时，抑制效果最好，抑制率达到40.8%；在较高浓度范围内，乙酸乙酯萃取物对酪氨酸酶的抑制率逐渐降低，最低为6.8%。

茯苓皮三萜乙酸乙酯萃取物对酪氨酸酶的抑制率与阳性对照品VC相比，茯苓皮三萜乙酸乙酯萃取物在低浓度和高浓度范围内，对酪氨酸酶的抑制效果均不如VC。只有在中间浓度5 mg/mL时，乙酸乙酯萃取物对酪氨酸酶的抑制率高于VC。

2.2.4不同浓度茯苓皮三萜正丁醇萃取物对酪氨酸酶的抑制作用

不同浓度的茯苓皮三萜正丁醇萃取物对酪氨酸酶活性抑制作用见图4。

图4　不同浓度茯苓皮三萜正丁醇萃取物对酪氨酸酶活性抑制作用Fig.4 The inhibition of different concentrations of n-butanol extract of Poria peel triterpenoids on tyrosinase activity

由图4可知，在所测定浓度范围内，茯苓皮三萜正丁醇萃取物对酪氨酸酶的抑制作用与乙酸乙酯萃取物相似，同样是先降低后升高，达到最高值后再次呈下降的趋势。在5 mg/mL时，抑制效果最好。

茯苓皮三萜正丁醇萃取物对酪氨酸酶的抑制率与阳性对照品VC相比，茯苓皮三萜正丁醇萃取物在中间浓度5 mg/mL时，其抑制率高于VC。在7 mg/mL时，正丁醇萃取物的抑制率与VC相等。其他浓度样品对酪氨酸酶抑制率均小于VC在该浓度的抑制。

2.3茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶的酶学抑制机理研究

2.3.1茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶的机理

在茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶活性反应体系中，固定L-酪氨酸的浓度，改变酪氨酸酶的浓度，测定不同浓度茯苓皮三萜对酪氨酸酶催化L-酪氨酸氧化活力的影响，用反应速度对酶浓度作图，得到了茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶的机理，见图5。

图5　茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶活力抑制机理Fig.5 Activity inhibition mechanism of Poria peel triterpenoids inhibit tyrosinase

由图5可知，酪氨酸酶在含茯苓皮三萜提取物的抑制体系中，酶的活力与加入酶浓度作图，得到一组平行线且此组平行线并未通过原点。随着茯苓皮三萜提取物浓度的增大，直线与X轴的交点逐渐右移，说明茯苓皮三萜提取物可能会与酪氨酸酶的活性部位以共价键的方式结合从而会引起酶活力的降低，此抑制作用属于不可逆过程。

2.3.2茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶活力的反应进程

以茯苓皮三萜提取物为效应物，测定马铃薯酪氨酸酶催化L-酪氨酸反应生成黑色素的反应进程，以时间为横坐标，生成黑色素的吸光度为纵坐标作图，反应进程曲线见图6。

从图6中的试验结果表明，随着酪氨酸酶催化反应体系中茯苓皮三萜提取物浓度的增大，酪氨酸酶催化反应时间有明显迟滞现象（曲线直线部分与X轴的交点表示迟滞时间），催化反应达到稳定态时的斜率明显减小。因此，茯苓皮三萜对马铃薯酪氨酸酶活性具有明显的抑制效应。同时，随着茯苓皮三萜提取物浓度的增大，酪氨酸酶的稳定态的活力显著降低。

图6　茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶活力的反应进程Fig.6 The reaction process of Poria peel triterpenoids inhibit tyrosinase

迟滞现象是酪氨酸酶单酚酶活性的特征现象，分析茯苓皮三萜类物质在抑制酪氨酸酶活性的过程中产生迟滞现象的原因，可能是因为酪氨酸酶的自身结构特点使L-酪氨酸与酪氨酸酶结合的过程中空间位阻变大，导致传质速度降低进而对酪氨酸酶抑制作用的反应速度产生影响，使其反应速度降低。茯苓皮三萜作为抑制剂使L-酪氨酸更难与酪氨酸酶活性位点结合，因此导致迟滞时间延长。

3　结论与讨论

通过对比不同茯苓皮三萜对酪氨酸酶的最大抑制率可知，在浓度为3 mg/mL时茯苓皮三萜氯仿萃取物对酪氨酸酶的抑制率为52.6%。在浓度为5 mg/mL时茯苓皮三萜粗提取物对酪氨酸酶的抑制率可达43.4%，抑制效果仅次于茯苓皮三萜氯仿萃取物。从经济成本的角度来讲，茯苓皮为生产废料，使用成本低并且有较好的抑制酪氨酸酶的功效，因此具有较高的经济利用价值。乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对酪氨酸酶的抑制率虽相对较低，但在一定浓度范围内抑制率均高于VC。

结合茯苓皮三萜粗提取物及萃取物中三萜化合物的含量可以推断，提取物中三萜化合物的含量对抑制酪氨酸酶的活性有直接的影响，提取物中三萜物质含量高，其对酪氨酸酶的抑制作用越强；另外，氯仿萃取物表现出了较好地抑制效果，所以氯仿可作为茯苓皮三萜化合物良好的萃取剂。

通过研究茯苓皮三萜对酪氨酸酶抑制机理和反应进程，结果表明：茯苓皮三萜对酪氨酸酶活性具有明显的抑制效应，属于不可逆抑制；同时，随着茯苓皮三萜提取物浓度的增大，酪氨酸酶的稳定态的活力显著降低，说明茯苓皮三萜是通过降低酶活力的稳定态从而达到抑制酶活的效果。刘有停［17］在对熊果苷抑制酪氨酸酶的动力学机制研究中发现，α-熊果苷对酪氨酸酶的抑制属于不可逆抑制，对酶活力的影响表现为降低蘑菇酪氨酸酶的稳态酶活力，同样会延长酶催化反应的迟滞时间。而有一些天然活性物质对酪氨酸酶的抑制会表现为可逆型抑制作用，造成抑制类型不同的原因可能是由于其活性物质的结构不同从而使天然抑制剂与酶产生了不同的作用方式［18］。

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Analysis of the Whitening Active of Triterpenoids from Poria cocos Peel and Mechanism of Tyrosinase Inhibition

CHENG Shui-ming1，LEI Xiao-yu2，LIU Bing-jie2，LIU Ying2，WANG Yi2，HUANG Wen2，*
（1. College of Environmental and Bioengineering，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000，Guangdong，China；2. College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，Hubei，China）

Abstract：In order to investigate the healthgiving benefit of triterpenoids in Poria cocos peel on the inhibition against tyrosinase and enhance both the applications of Poria peel in production and processing and its added value，the inhibition of triterpenoids from Poria cocos peel against tyrosinase was tested using in vitro biochemical enzymatic method and its mechanism was explored initially. The results showed that the inhibitory effect of chloroform extract on tyrosinase was the best and chloroform was a good extraction agent；meanwhile the inhibition was irreversible.

Key words：Poria cocos peel；triterpenoids；tyrosinase；inhibition rate

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.005

基金项目：广东省高等学校人才引进专项基金（粤财教［2012］41号）

作者简介：程水明（1966—），男（汉），教授，博士，研究方向：食品微生物学。

*通信作者

收稿日期：2015-03-16