20(R)-人参皂苷Rg3对人乳腺癌细胞自噬作用的影响

陈凯云 何洁 梁文丽

20(R)-人参皂苷Rg3对人乳腺癌细胞自噬作用的影响

陈凯云 何洁 梁文丽

目的 观察20(R)-人参皂苷Rg3对人乳腺癌细胞（MCF-7）自噬作用的影响，并探讨20(R)-人参皂苷Rg3诱导MCF-7自噬作用的最佳剂量。方法 人乳腺癌细胞株分为20(R)-人参皂苷Rg3实验组及空白对照组。采用MTT法观察20(R)-人参皂苷Rg3对MCF-7细胞生长的抑制作用，并依据计算出的IC50值确定20(R)-人参皂苷Rg3的有效浓度。结果 当20(R)-人参皂苷Rg3浓度在37.5～600.0mg/L时，MCF-7细胞的生长抑制率最高，并随其浓度的增加而增大，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。在荧光显微镜下观察到细胞所含自噬泡明显增多，说明20(R)-人参皂苷Rg3可诱导乳腺癌细胞自噬。蛋白质印迹法检测结果显示：LC3蛋白，特别是LC3-II的表达量与细胞自噬程度呈正相关，随着20(R)-人参皂苷Rg3干预浓度的增大，LC3-I和LC3-II蛋白表达量亦明显升高，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 20(R)-人参皂苷Rg3能显著抑制MCF-7细胞的增殖，且呈现良好的剂量、时间依赖性；20(R)-人参皂苷Rg3有诱导MCF-7细胞自噬作用。

20(R)-人参皂苷Rg3；人乳腺肿瘤细胞；细胞自噬

中药人参中的四环三萜皂苷，又称20(R)-人参皂苷Rg3。以往研究证实20(R)-人参皂苷Rg3具有抑制实验动物体内移植肿瘤的生长、浸润和转移作用[1-3]，一些抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞增殖机制是通过诱导肿瘤细胞自噬活性来实现的[4-7]。20(R)-人参皂苷Rg3对人乳腺癌细胞（MCF-7）是否也具有同样作用机制有待进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞株（MCF-7）购于上海细胞研究所；20(R)-人参皂苷Rg3购于中国药品生物制品检定所；胎牛血清购于杭州四季青生物工程公司；DMEM培养基、胰酶、胎牛血清（Hyclone公司，AQC23410）；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)液（华舜生物试剂公司）、3-甲基腺嘌呤(3-methlyadenine，3-MA)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购于Sigma公司；抗LC3单抗（包括LC3-I和LC3-II）购自MBL CO.(Woburn，MA，USA，131220)。

1.2 方法

1.2.1 20(R)-人参皂苷Rg3溶液的制备 首先将20(R)-人参皂苷Rg3用DMSO溶解为100mg/mL浓度的溶液10mL，备用；使用前用含10%新生牛血清的DMEM培养液稀释成实验设计所需的浓度(37.5，75.0，150.0，300.0，600.0μg/mL)，DMSO终浓度＜0.1%。

1.2.2 人乳腺癌细胞（MCF-7）的培养 在人乳腺癌细胞（MCF-7）培养液中融入100μL青霉素、100μL链霉素后，将MCF-7细胞贴壁置于DMEM培养液中，要求在37℃、5% CO2的饱和湿度条件下培养[5]，生长至80%～90%融合后传代，隔天换液1次。

1.2.3 MTT法测MCF-7细胞活性 观察组取对数生长期的MCF-7细胞加入96孔板内，每孔200μL，常规培养24h后，加入稀释后的20(R)-人参皂苷Rg3溶液，其终浓度分别为37.5，75.0，150.0，300.0及600.0mg/L；对照组加入含相应浓度乙二醇的10%新生牛血清DMEM培养液，继续培养24h，48h，72h。向各孔内加入MTT溶液20μL(5mg/L)，37℃、5%CO2孵育4h，终止培养。小心吸弃孔内上清液100μL DMSO，震荡10min，待沉淀完全溶解后用Bio-red550酶标仪测定490nm的吸光度值(A值)[5]；每组设3个平行孔，实验重复进行3次，取平均值，对不同浓度20(R)-人参皂苷Rg3诱导后的MCF-7细胞生长抑制率进行计算。

通过细胞生长抑制率及药物浓度作曲线求出IC50值。

细胞生长抑制率(%)=对照组细胞A值-加药组细胞A值/对照组细胞A值×100%。

1.2.4 在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成 在转染前12h将所需细胞经20（R）-人参皂苷Rg3处理

6d后的培养液，取1mL/L加入1μL MDC（50μmol/L）染液，37℃反应10min，去上清夜，PBS漂洗3次，用DAPI染色并封片。制作好的细胞切片以荧光显微镜观察GFP-LC3荧光聚集情况并拍照。

1.2.5 自噬体膜上标志性蛋白质检测 选择传代贴壁后细胞，加入DMEM高糖培养基（含10%CCFBS）培养48h，再分别加入含SPG-Rg3培养液，培养12h后吸出培养液，PBS洗2次，裂解细胞。将内容物移入离心管，离心15min(4℃，10000r/ min)。上清液置－20℃保存备用。用蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。定量取样品蛋白50ug，电泳后移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1h，弃溶液，每张膜分别加入兔抗ERKl／2、兔抗Phospho—ERKl／2、兔抗LC3B多克隆抗体、鼠抗GAPDH鼠单克隆抗体，4℃摇床12h，TBST洗膜3次，加辣根过氧化酶偶联的羊抗兔IgG，TBST洗膜3次。在膜上加HRP和AP化学发光检测底物，用荧光／化学发光成像系统成像分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件。计量资料采用“x±s”表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 20(R)-人参皂苷Rg3对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响 结果表明，20(R)-人参皂苷Rg3作用后的不同时间阶段（24，48，72h）后，20(R)-人参皂苷Rg3均能有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖，其不同浓度与作用时间有依赖性。见表1。

表1 20(R)-人参皂苷Rg3对MCF-7细胞增殖的抑制作用(n=54)

2.2 GFP-LC3融合蛋白示踪自噬形成 在荧光显微镜下观察到，对照组高亮阳性细胞较少，细胞所含高亮颗粒也很少，而实验组阳性细胞明显增多，形成多个明亮的绿色荧光斑点，说明细胞所含自噬泡也明显增多。说明20(R)-人参皂苷Rg3可诱导乳腺癌细胞自噬。见图1A和1B。

2.3 20(R)-人参皂苷Rg3对人乳腺癌MCF-7细胞膜标记水平的影响 蛋白质印迹法检测结果证实，与对照组比较，实验组的MCF-7细胞中的LC3蛋白、LC3-II蛋白表达上调，有显著性采用（P＜0.05），说明20(R)-人参皂苷Rg3可诱导乳腺癌细胞发生自噬，并且随着20(R)-人参皂苷Rg3浓度的增大，MCF-7细胞中的LC3-I和LC3-II蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05），并提示LC3蛋白，特别是LC3-II的表达量与细胞自噬程度呈正相关，即20(R)-人参皂苷Rg3能诱导MCF-7细胞自噬。见图1C。

图1 20(R)-人参皂苷Rg3与人乳腺癌MCF-7细胞的自噬体注：(A)在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成；(B)20(R)-20(R)-人参皂苷Rg3处理6d后观察到的自噬体(黑箭头)；(C)利用Western Blot法检测自噬体膜上LC3-II/I比值的变大

3 讨论

细胞自噬(autophagy)是一种程序化的细胞内降解过程，细胞通过溶酶体降解自身胞质成分实现细胞自身的代谢以及细胞器的更新，以维持细胞内环境稳态[1-3]。在肿瘤发生、发展的过程中，细胞自噬功能可防止有毒或致癌物质在胞内的累积，抑制细胞癌变。近年来一些抗肿瘤药物通过诱导细胞自噬活性来抑制肿瘤细胞增殖的报道日益增多[4-9]。

研究结果证实，20(R)-人参皂苷Rg3能显著抑制人乳腺癌细胞（MCF-7）的增殖，且呈现良好的剂量、时间依赖性。采用GFP-LC3融合蛋白示踪细胞自噬形成，利用Western Blot法检测自噬体膜上LC3-II/I比值的变化以此评价20(R)-人参皂苷Rg3诱导乳腺癌细胞MCF-7细胞自噬水平，本研究为20(R)-人参皂苷Rg3用于临床乳腺癌治疗打开新的思路。

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Objective To observe effect of autophagy of 20(R) - ginsenosides Rg3 on human breast cancer cell (MCF-7) and best dose of 20(R) -Rg3 ginsenosides induced MCF-7 autophagy function. Methods Human breast cancer cell lines was divided into experimental group of 20(R) -ginseng saponin Rg3 and the control group. Observe growth-inhibition of 20(R)-Rg3 ginsenosides on MCF-7 cell by MTT and according to the IC50 calculated determine the effective concentration of 20(R)-Rg3 ginsenosides. Results The MCF - 7 cell growth inhibition rate is highest and increases with the increasing of 20(R)-Rg3 ginsenosides concentration when the concentration of SPG-Rg3 was from 37.5 to 600.0mg/L.the cell growth was greatly inhibited compared with control group (P＜0.05).Increasing of cell autophagy bubble was observed under fluorescence microscope, which showed that 20(R)-Rg3 ginsenosides could induce autophagy breast cancer cells. Results showed that the expression of LC3 proteins, especially LC3-II was positively associated with the degree of cell autophagy, with 20(R) - ginseng saponin Rg3 intervention with the increasing of concentration and amount of LC3-I and LC3-II protein expression also increased significantly by protein imprinting method , there was difference compared with control group (P＜0.05). Conclusion 20(R)-Rg3 ginsenosides could inhibit the MCF-7 cell proliferation, and good dose and time relation of MCF-7 cell autophagy induced by 20(R)-Rg3 ginsenosides.

20(R)-Rg3 ginsenosides; Human breast tumor cells; Cell autophagy

江西 330003 南昌大学第四附属医院 （陈凯云 梁文丽）330000 南昌市第一医院 （何洁）