柴胡注射液对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖及凋亡的影响*

延安大学医学院(延安 716000)

刘晓斌　张正祥　吉金山　张欠欠　艾彩莲　刘　烨△　惠起源△



柴胡注射液对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖及凋亡的影响*

延安大学医学院(延安 716000)

刘晓斌张正祥吉金山张欠欠艾彩莲刘烨△惠起源△

摘要目的：探讨柴胡注射液对人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡的影响及相关机制。方法：将人肝癌SMMC-7721细胞株(由西安交通大学医学院第一附属医院临床分子试验中心提供)分为空白对照组(加10%小牛血清的1640培养液)、氟尿嘧啶阳性对照组(10μg/ml)及实验组(分别为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml柴胡注射液)。采用噻唑蓝比色法(即MTT)检测人肝癌细胞株SMMC-7721对柴胡注射液药物和氟尿嘧啶注射液的敏感性；应用流式细胞术(FCM)检测柴胡注射液对人肝癌细胞株(SMMC-7721细胞)周期的影响。结果：柴胡注射液对SMMC-7721的生长有明显的抑制作用，抑制率与柴胡注射液浓度呈正相关。不同浓度柴胡注射液处理肝癌细胞时，药物浓度与凋亡细胞且呈剂量依赖关系。结论：柴胡提取物可抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖，诱导其凋亡，作用机制可能与调控细胞周期有关。

主题词肝肿瘤，实验性细胞增殖细胞凋亡柴胡注射液

目前，对于中、晚期肝癌患者的治疗，根据病情采用中医中药治疗、放疗、化疗、冷冻、肝动脉栓塞化疗等多种方法, 但疗效均不理想。研究表明,柴胡可通过保护肝细胞、杀伤或抑制细胞增殖的肝癌、诱导肝癌细胞凋亡、提高机体免疫力以及逆转肝癌细胞耐药等发挥抗肝癌作用[1]。本研究以人肝癌SMMC-7721细胞为实验对象，研究柴胡注射液对肝癌细胞凋亡和增殖的影响，分析柴胡注射液对癌细胞周期的影响。

资料与方法

1 材料

1.1 细胞株：人肝癌SMMC-7721细胞株由西安交通大学医学院第一附属医院临床分子试验中心提供。该细胞株在含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中呈单层生长，维持培养于37℃、5%CO2、95%空气湿度的培养箱中。3～5d传代一次，传代时将原配养液吸出，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化1min，然后加入6ml新培养液终止消化，继而用培养液吹打制成细胞悬液传代或接种。

1.2试剂及主要仪器： 柴胡注射液由河南淅川制药厂生产；RPMI1640 培养基购自GIBCO公司；胰蛋白酶干粉(批号:810214)、酚红(批号: 831008)：上海化学试剂厂生产；小牛血清：武汉三利生物技术有限公司生产；噻唑蓝(MTT)、 二甲基亚砜(DMSO)：均购自美国SIGMA公司；氟尿嘧啶注射液：北京北大药业有限公司生产(GMP)； 流式细胞仪(型号:calber)：BD公司生产；酶联检测分析仪(型号-680)：美国伯乐。

2方法

2.1样品液配制及实验分组

2.1.1小牛血清(100ml/瓶)：-20℃冰箱保存, 将小牛血清在56℃水浴中灭活(30min)后按1∶ 9的比例加入培养液，制成10%的小牛血清培养液。

2.1.2 0.25%胰蛋白酶溶液：准确称取胰蛋白酶干粉0.25g，溶于RPMI 1640培养液中，稀释至100ml，搅拌均匀后，保存于4℃冰箱，过夜后超净台抽滤除菌，取样做无菌试验，然后-20℃冰箱保存备用。

2.1.3PBS干液(10×PBS，pH7.2)：KCl 0.2g，NaCl 9.0g， KH2PO40.27g，NaH2PO4·12H2O2.85g，双蒸水100ml在振荡器上充分混匀，4℃保存备用。

2.1.4PBS工作液(1×PBS)：PBS干液50ml、双蒸水450ml充分混匀分装，103.4kPa(121.3℃)灭菌15min，4℃保存备用。

2.1.5MTT液： PBS工作液配成5mg/ml过滤除菌，避光-20℃保存备用。

2.1.6 柴胡注射液实验组：将柴胡注射液(每ml含生药1g)溶于1640培养液中，分别制成5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml五组浓度梯度，并过滤除菌，于4℃保存备用。

2.1.7阳性对照组：用灭菌生理盐水将5-氟尿嘧啶(5-Fu)注射液稀释成10μg/ml浓度，过滤除菌，4℃保存备用。

2.1.8阴性对照组：加入与实验组相同体积的完全培养液。

2.1.9 空白对照组：加入与实验组相同体积的完全培养液。

2.2 检测方法与统计学方法： 采用噻唑蓝比色法(MTT)检测人肝癌SMMC-7721细胞株对不同浓度柴胡注射液药物和氟尿嘧啶注射液的敏感性，用流式细胞术( FCM) 检测不同浓度柴胡注射液药物和氟尿嘧啶注射液对人肝癌SMMC-7721细胞株周期的影响。运用SPSS17．0统计学软件，计量资料采用t检验，α=0.05(双侧)作为检验标准；计数资料应用Fisher确切概率法进行统计分析。

结果

1柴胡注射液对人肝癌SMMC-7721细胞株增殖的抑制柴胡注射液可抑制SMMC-7721细胞，抑制率随柴胡注射液浓度的升高而增加；其中，浓度为50mg/ml柴胡注射液组对SMMC-7721细胞的抑制率为49.82%，接近半数抑制率。柴胡注射液5mg/ml组与阴性对照组比较差异无统计学意义，25mg/ml柴胡注射液组与阳性对照组比较差异无统计学意义，其余各组间比较，差异有统计学意义,见表1、2。

表1　柴胡注射液实验组、阴性、阳性对照组及空白组OD值

表2　各组对SMMC-7721细胞活性及功能状态影响

注：抑制率=(对照组OD-实验组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%

2流式细胞仪检测人肝癌细胞株SMMC-7721的细胞周期柴胡注射液对SMMC-7721细胞作用12h后，经流式细胞术检测不同浓度柴胡注射液对SMMC-7721细胞周期的影响，结果显示经柴胡注射液作用后的的肝癌细胞株G1期细胞的百分比不断减少,见表3。

3流式细胞仪检测SMMC-7721细胞凋亡率未用药时，凋亡细胞仅占2.32%，并且未出现凋亡峰。而当用5mg/ml、10mg/ml、25mg/ml、50mg/ml柴胡注射液处理细胞12h后均出现了凋亡峰，凋亡细胞分别占总细胞数的13.62%、15.32%、23.32%、30.42%，随着药物浓度的增大凋亡率也增大，且呈剂量依赖关系。

表3　不同浓度柴胡注射液对SMMC-7721

讨论

茅敏等[2]通过体内实验得出小柴胡汤抗肿瘤的作用机制一方面可能与其诱导肿瘤细胞凋亡有关，另一方面可影响肿瘤细胞周期，造成其增殖指数降低，从而在一定程度上控制了肿瘤的增殖。乔喜婷等报道[3],柴胡主要活性成份柴胡皂苷具有对抗多种因素导致的肝损伤和肝纤维化的作用。细胞死亡是由正常的细胞周期改变而引起，细胞凋亡与细胞周期阻滞有关，细胞阻滞于哪一期，凋亡就发生在哪一期。本实验研究显示，随柴胡注射液剂量增加，G1期SMMC-7721细胞比率不断减少，且呈剂量依赖性，而柴胡注射液对SMMC-7721细胞的抑制也呈剂量依赖性，表明柴胡注射液可能阻滞SMMC-7721细胞于G1期，并且通过诱导期凋亡而产生抗肿瘤作用。

王艳丽等[4]的MTT法测定结果显示：SSd(柴胡皂d)对肝癌SMMC-7721细胞株的增殖有明显的抑制作用，随着SSd作用浓度和时间的变化而改变，在一定的范围内呈明显的剂量和时间依赖性。胡淑婷[5]等报道结果显示与对照组比较，实验组细胞的生长受到明显抑制，差异均有统计学意义。本实验研究显示柴胡注射液处理SMMC-7721细胞株后，活细胞数目减少，癌细胞功能受抑制，抑制率随浓度的升高而增加。当柴胡注射液浓度为50mg/ml时，对SMMC-7721细胞的抑制率(49.82%)接近半数抑制率；而且当柴胡注液浓度达到25mg/ml时, 其抑制率与氟尿嘧啶10μg/ml对照组的抑制率相差无几，这一结果与唐婷婷[1]等报道结果相一致。

流式细胞术是近年来广泛用于肿瘤细胞诊断及细胞动力学等领域的新技术，它通过DNA含量分析细胞周期分布，从而反映肿瘤细胞的增殖状态。本研究结果显示，经柴胡注射液作用后的肝癌细胞株G1期细胞的百分比不断减少，说明人肝癌细胞株SMMC-7721主要被抑制在Gl期。同时显示未用药时，凋亡细胞仅占2.32%，并且未出现凋亡峰；而当用不同浓度柴胡注射液处理细胞12h后均出现了凋亡峰，并且随着药物浓度的增大凋亡率也增大，呈剂量依赖关系。

可见，柴胡注射液中的有效成分可抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖，诱导肝癌细胞凋亡。但不同学者报道的柴胡注射液对SMMC-7721的量效关系结果不完全相同，表明在肝癌的治疗中运用柴胡需足量，其制剂用于治疗肝癌时则需对有效成分进行精提取。

参考文献

[1]唐婷婷, 施贝德.柴胡注射液抑制人肝癌细胞株HepG2增殖的实验研究[J].亚太传统医药,2011,7(5):27-29.

[2]茅敏,付虹,黄秀深,等.小柴胡汤诱导荷瘤小鼠S180细胞凋亡及对细胞周期的影响[J].现代中西医结合杂志,2005,14(20):2646-2648.

[3]乔喜婷，王克穷，代引海，等.小柴胡汤联合肝动脉化疗栓塞术治疗原发性肝癌的临床观察[J].陕西中医，2014，35(7)：835-836.

[4]王艳丽,和水祥,罗金燕,等.柴胡皂甙对肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制作用[J].西安交通大学学报(医学版),2006,27(6):572-574.

[5]胡淑婷,奥海航,王英华,等.小叶黑柴胡诱导人胃腺癌MGC-803细胞凋亡的实验研究[J].宁夏医学院学报,2007,29(1):13-16.

(收稿：2015-03-23)

Effect of radix bupleuri injuction on hunman hepatic carcinoma cells' proliferation and apoptosis

The Medical College of Yan'an University(Yan'an 716000)

Liu XiaobinZhang Zhenxiang Ji Jinshanet al

ABSTRACTObjective: To investigate the effect of bupleurum injection on human hepatic carcinoma cells'(SMMC-7721) apoptosis and related mechanisms. Methods: With different concentrations (0, 5, 10, 20, 25, 50mg/ml) treatment liver cancer SMMC-7721 cell line, determined by MTT method in different concentrations of tumor cells after treated by inhibiting rate; FCM detect different concentrations of radix bupleuri injection effect on SMMC-7721 cell cycle. Results: Different concentrations of radix bupleuri injection processing SMMC-7721 cell, number of living cells, cancer cells function inhibition, inhibition rate and radix bupleuri injection concentration were positively correlated, when the concentration of radix bupleuri injection of 50mg/ml, inhibition rate reached the maximum. Radix bupleuri injection 5mg/ml, 10mg/ml, 25mg/ml, 50mg/ml dealing with cells, apoptosis cells respectively accounted for 13.62%, 15.32%, 23.32%, 30.42% of the total, apoptosis rate increased with the increase of drug concentration, and a dose-response relationship. Conclusion: Bupleurum extract can inhibits human hepatic carcinoma SMMC-7721 cells' proliferation, induce its apoptosis, and the mechanism of action may be related to the regulation of cell cycle.

KEY WORDSLiver neoplasms,experimentalCell proliferationApoptosisChai hu zhu she ye

【中图分类号】R392.5

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.008

*陕西省教育厅专项科研基金项目(11JK0669)

△延安大学附属医院