BMSC对经基因沉默肝癌组织的影响

李天然，黄晓斌，宋 斌，卢光明，李延军

1． 解放军第304医院放射科，北京 100048； 2. 解放军第九五医院放射科； 3. 解放军南京总医院医学影像科

BMSC对经基因沉默肝癌组织的影响

李天然1，黄晓斌2，宋 斌2，卢光明3，李延军3

1． 解放军第304医院放射科，北京 100048； 2. 解放军第九五医院放射科； 3. 解放军南京总医院医学影像科

目的 观察BMSC对经基因改造的具有不同转移潜能肝癌的影响。方法 63只裸鼠随机分成8组:MHCC97-L组(9只)、MHCC97-L NC组(8只)、MHCC97-L OPN沉默组(8只)、MHCC97-L TGFβ1沉默组(5只)、MHCC97-H组(8只)、MHCC97-H NC组(8只)、MHCC97-H OPN沉默组(9只)、MHCC97-H TGFβ1沉默组(8只)。 肿瘤体积50 mm3左右开始瘤内注射人间充质干细胞BMSC，1×105/只，每周2次，连续4 周。计算瘤体积抑制率(%)和瘤重抑制率(%)，BMSC对经基因沉默的肝癌动物模型干预结果进行病理检测。结果 与MHCC97-L组比，BMSC对MHCC97-L NC组瘤体积和瘤重均有促进作用，与MHCC97-L组比，BMSC对MHCC97-L OPN沉默组瘤体积和瘤重均有明显的抑制作用，而BMSC对MHCC97-L TGFβ1沉默组瘤体积和瘤重均有促进作用。与MHCC97-H组比，BMSC对MHCC97-H NC组瘤体积和瘤重均有轻度抑制作用，与MHCC97-H组比，BMSC对MHCC97-H OPN沉默组和MHCC97-H TGFβ1沉默组瘤体积和瘤重均有显著的抑制作用。与MHCC97-H组及MHCC97-H NC组比较，MHCC97-H OPN沉默组纤维增生及核分裂象较少，而MHCC97-H TGFβ1沉默组纤维增生明显，核分裂象较多。与MHCC97-L比较，MHCC97-L NC、MHCC97-L OPN沉默组、MHCC97-L TGFβ1沉默组见较多坏死区、较多肿瘤细胞凋亡、坏死，并可见数个核分裂象。结论 抑制肿瘤OPN表达BMSC可更好地抑制肿瘤的增殖，而抑制肿瘤TGFβ1表达BMSC并不能抑制肿瘤的增殖。相应的抗体沉默OPN可能是治疗肿瘤的一个比较好的靶点，配合BMSC生物治疗会提高治疗的生物效能。

肝癌；骨髓间充质干细胞；转移；骨桥蛋白；肿瘤生长转化因子

目前基于自体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)的生物治疗是比较有前景的生物治疗手段，相应的基础研究也从多方面展开[1]。然而，BMSC对肿瘤的干预效能仍然存在许多不确定的方面，如干细胞的成瘤性、干细胞长时间的干预效能、干细胞对肿瘤生物学行为的影响等需要进一步研究和观察[2]。本课题研究组前期通过基因工程技术对BMSC进行改造，使其增加转移性相关基因骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)、肿瘤增殖性基因肿瘤生长因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)的表达，观察经基因修饰的BMSC对具有不同转移潜能肝癌的影响情况，研究结果显示外源性生物因子可以促进肿瘤细胞的增殖和转移[3-4]。在此基础上，对具有高低转移潜能的肝癌细胞中转移相关基因OPN和肿瘤增殖相关基因TGFβ1进行沉默(SiRNA)，观察BMSC对经基因修饰的肝癌细胞影响，下一步寻找合适的抑制肝癌转移和增殖的目的基因，为基于BMSC的生物治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器及试剂 电子天平(上海天平仪器厂，FA1104型)，超低温冰箱(青岛海尔集团，型号：BS-812)，净化工作台(上海新苗医疗器械制造有限公司，SW-CJ-2D型)。0.9%氯化钠注射液：浙江莎普爱思药业股份有限公司，批号：130629-2。

1.2 动物饲料

1.2.1 维持饲料：由上海斯莱克实验动物有限公司提供，执行标准GB14924.3-2010《实验动物配合饲料营养成分》。

1.2.2 实验动物及饲养条件：实验用BALB/c雄性裸小鼠均由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号为SCXK(沪)2012-0002，SPF级，动物质量合格证号为0205939，购入时动物体质量为20 g左右。饮用水为灭菌二级超纯水，饮用水质量符合中华人民共和国国家标准《生活饮用水卫生标准》 (GB5749-2006)的规定。实验动物房使用许可证号为SYXK(浙)2015-0008，饲养环境：温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%。裸小鼠实验前在动物房环境中适应6 d。

1.3 实验方法

1.3.1 高低转移潜能肝癌动物模型分组： 63只裸鼠随机分成8组：MHCC97-L组(9只)、MHCC97-L NC组(8只)、MHCC97-L OPN沉默组(8只)、MHCC97-L TGFβ1沉默组(5只)、MHCC97-H组(8只)、MHCC97-H NC组(8只)、MHCC97-H OPN沉默组(9只)、MHCC97-H TGFβ1沉默组(8只)。

1.3.2 高低转移潜能肝癌动物模型制作方法： 收集处于对数生长期的各组细胞株，1 000 r/min 离心5 min，调整细胞浓度至 2.5×107个/ml，制备单细胞悬液。63只裸鼠分别自右侧腋下接种相应组别细胞悬液0.2 ml，含细胞数 5×106个/只，注射后注射部位局部按压30 s，防止细胞悬液从针孔流出。注射局部出现明显皮丘，复制皮下移植瘤模型。

1.3.3 BMSC干预动物方法：肿瘤体积50 mm3左右开始瘤内注射人骨髓间充质干细胞BMSC，1×105/只，每周2次，连续4 周。

1.4 指标检测方法 各组裸鼠于细胞接种后1 周开始称重并测量瘤块体积，1 周3 次，用游标卡尺测量瘤体的最长径(a)和最短径(b)，计算肿瘤体积(V)，V(cm3)= 1/2ab2=0.5ab2， 绘制肿瘤生长曲线。动物体质量：1 周3 次测量动物总体质量，动物体质量=总体质量-肿瘤体积(假设肿瘤密度为1)。计算：

瘤体积抑制率(%)=(1-实验组平均瘤体积/对照组平均瘤体积)×100%；瘤重抑制率(%)=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。实验结束后处死动物， 分别称体质量和瘤重，4%甲醛固定，用于病理检测。

2 结果

2.1 一般性观察结果 裸鼠接种第13天，肿瘤体积>50mm3，开始进行瘤内注射人BMSC细胞进行干预。移植瘤模型建立初期，各组裸鼠的饮食、大小便、行为和精神状态无明显差异。随着实验进行，各组裸鼠皮下肿瘤逐渐增大，MHCC97-LOPN沉默组与MHCC97-L组比较，MHCC97-HOPN沉默组、MHCC97-HTGFβ1沉默组与MHCC97-H组比较均有明显抑制效果。实验结束处死各组裸鼠并剥离瘤体，可见瘤体与周围组织界限清晰，与皮肤和皮下结缔组织轻微粘连，包膜完整。

2.2BMSC干预经基因修饰前后具有不同转移潜能肝癌皮下移植瘤模型肿瘤生长体积和肿瘤重量变化

2.2.1 经BMSC细胞干预肿瘤至肿瘤接种后第40天，处死动物，对瘤体体积和重量进行统计，结果显示，BMSC对经OPN基因沉默的MHCC97-L动物模型肿瘤体积明显缩小，但肿瘤的重量无明显变化。而BMSC对经TGFβ1基因沉默的MHCC97-L肿瘤体积和重量抑制作用不明显，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

与MHCC97-H及MHCC97-HNC组比较，经OPN、TGFβ1沉默的MHCC97-H肿瘤体积缩小明显，而相应肿瘤重量反而增加(P<0.01，见表2)。

肿瘤体积(mm3)肿瘤重量(g)MHCC97⁃L2611．36±883．8721．07±1．23MHCC97⁃LNC3010．30±596．4222．43±2．30MHCC97⁃LOPN582．33±322．51∗∗∗22．86±2．32MHCC97⁃LTGFβ12754．90±1909．5320．85±4．11

注：与其他3组比较，***P<0.001。

肿瘤体积(mm3) 肿瘤重量(g) MHCC97⁃H3064．90±821．7820．52±3．32MHCC97⁃HNC2776．62±704．3618．90±1．87MHCC97⁃HOPN1200．25±181．59∗∗23．72±2．53∗∗MHCC97⁃HTGFβ1595．83±343．83∗∗∗23．34±2．23∗∗

注：与其他3组比较，***P<0.001；与MHCC97-H和MHCC97-H NC组比较，**P<0.01。

2.2.2 截至到肿瘤接种后第40天，经BMSC细胞干预高低不同转移潜能肝癌动物模型各个时间点平均肿瘤体积和重量进行统计分析，由图1可见，MHCC97-H OPN和MHCC97-H TGFβ1沉默组与MHCC97-H组和MHCC97-H NC组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，表明BMSC对经基因修饰的MHCC97-H OPN和MHCC97-H TGFβ1沉默组的肿瘤体积具有明显的抑制作用。由图2可见，BMSC对经OPN基因修饰的MHCC97-H肿瘤模型重量具有促进作用(P<0.001)，而对经TGFβ1基因修饰的MHCC97-H肿瘤模型重量无明显抑制作用。

由图3、图4可见，BMSC对经OPN基因沉默的MHCC97-L肿瘤体积具有明显的抑制作用，BMSC对经基因修饰的MHCC97-L肿瘤模型瘤重具有促进作用(P<0.001)。

注：与MHCC97-H TGFβ1和MHCC97-H OPN组比较,***P<0.01,**P<0.05。

图1 BMSC干预MHCC97-H肿瘤40 d平均肿瘤体积比较直方图

Fig 1 Comparison of the mean tumor volume of MHCC97-H after intervention 40 days by BMSC,

注：与MHCC97-H 和MHCC97-H NC组比较,***P<0.01。

注：与其他3组比较，***P<0.01。

注：与其他3组比较，***P<0.01。

2.3 肝癌肿瘤抑制率计算结果 抑制率包括：肿瘤体积抑制率、肿瘤重量抑制率。抑制率计算去除各种干扰因素，作为BMSC对肝癌组织作用的最终评判，结果如表3所示，与MHCC97-L组比，BMSC对MHCC97-L NC组瘤体和瘤重均有促进作用，与MHCC97-L组比

表3 BMSC对具有高低转移潜能肝癌经基因修饰前后抑制率分析(%)

Tab 3 Inhibitory rate of BMSC on hepatocellular carcinoma with high and low metastatic potential before and after gene modification (%)

瘤体抑制率瘤重抑制率MHCC97⁃L组0．000．00MHCC97⁃LNC组-15．28-4．74MHCC97⁃LOPN组77．7051．28MHCC97⁃LTGFβ1组-5．50-73．58MHCC97⁃H组0．000．00MHCC97⁃HNC组9．414．99MHCC97⁃HOPN组60．8447．23MHCC97⁃HTGFβ1组80．5684．08

较，BMSC对MHCC97-L OPN沉默组瘤体和瘤重均有明显的抑制作用，而BMSC对MHCC97-L TGFβ1沉默组瘤体和瘤重均有促进作用。与MHCC97-H组比，BMSC对MHCC97-H NC组瘤体和瘤重均有轻度抑制作用，与MHCC97-H组比，BMSC对MHCC97-H OPN沉默组和MHCC97-H TGFβ1沉默组瘤体和瘤重均有显著的抑制作用。

2.4 BMSC对经基因修饰前后的具有不同转移潜能的肝癌动物模型干预结果病理 MHCC97-H组和MHCC97-H NC组可见较多肿瘤坏死区，纤维增生明显，核分裂象较多。与MHCC97-H组和MHCC97-H NC组比较，MHCC97-H OPN沉默组纤维增生及核分裂象较少，而MHCC97-H TGFβ1沉默组纤维增生明显，核分裂象较多(见图5)。

与MHCC97-L组比较，MHCC97-L NC组、MHCC97-L OPN沉默组、MHCC97-L TGFβ1沉默组见较多坏死区，较多肿瘤细胞凋亡、坏死，并可见数个核分裂象(见图6)。

图5 BMSC对基因沉默前后肝癌组织干预病理结果(HE染色 200×) A：MHCC97-H组；B：MHCC97-H NC组；C：MHCC97-H OPN沉默组；D：MHCC97-H TGFβ1沉默组

Fig 5 BMSC on the gene silencing before and after the intervention of HCC tissue pathology results (HE staining 200×) A: MHCC97-H blank control group; B: MHCC97-H gene silencing negative control group;C: MHCC97-H OPN gene silence group; D: MHCC97-H TGFβ1 silence group

图 6 BMSC对基因沉默前后肝癌组织干预病理结果(HE染色 200×) A：MHCC97-H组；B：MHCC97-H NC组；C：MHCC97-H OPN组；D：MHCC97-H TGFβ1沉默组

Fig 6 BMSC on the gene silencing before and after the intervention of HCC tissue pathology results (HE staining 200×) A: MHCC97-H blank control group; B: MHCC97-H gene silencing negative control group; C: MHCC97-H OPN gene silence group; D: MHCC97-H TGFβ1 silence group

3 讨论

干细胞技术可分为正常干细胞技术和癌干细胞技术。正常干细胞技术(normal stem cells, NSCs)指利用人体正常的干细胞进行肿瘤的干预技术，观察人体正常干细胞对肿瘤组织或肿瘤细胞的作用。BMSC移植对肿瘤治疗是比较有前景的手段，对肝脏疾病，自体骨

髓干细胞具有生成肝细胞和胆管细胞的能力，容易采集，可避免移植排斥反应，移植过程简单易行、治疗费用低廉、不违反医学伦理道德等优点而成为肝癌生物治疗的热点研究内容[5-6]。

有研究已经证实，骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)是一种分泌型磷酸化糖蛋白，其分子结构中含有RGD(Arg-Gly-Asp)多肽序列。OPN主要通过与其受体整合素和CD44相互作用，参与肿瘤转移的多个过程[7]。前期我们研究表明，外源性OPN通过抑制MHCC97-H细胞释放内源性OPN而发挥促进肿瘤侵袭的作用，主要通过激活MMP-2因子发挥作用[3]。另外， TGFβ1是参与肿瘤的增殖、侵袭转移重要生物因子。TGFβ1因子与整合素αvβ3受体在肿瘤转移相关信号通路上具有联系，即整合素与TGFβ1受体介导的两条信号传导通路不仅共用某些信号分子，而且共同作用于多种生物效应并相互促进[8]。本课题组注意到前期研究还发现， TGFβ1与肿瘤的增殖行为有关，在高低转移潜能肝癌细胞也存在差异[4]。基因修饰是肿瘤研究中常见的手段与方法，为观察BMSC对肝癌的作用效能，本研究通过基因工程技术手段，分别沉默(siRNA)高低转移潜能肝癌细胞中OPN和TGFβ1两种基因，使之减少表达OPN、TGFβ1生物活性因子，通过与BMSC共培养观察对其转移潜能和增殖潜能的影响。

本研究抑制率结果发现，经OPN基因沉默的高低转移潜能肝癌动物模型，BMSC干预后其肿瘤体积和肿瘤重量均具有明显的抑制作用，大体病理结果证实，与对照组比较肿瘤的坏死成分增多，核分裂象减少，纤维成分增多，肿瘤组织中成分的变化是造成肿瘤体积和重量受抑制的原因。这也表明，OPN在肿瘤组织中的作用，OPN的减少促进了细胞的凋亡，延缓了肿瘤细胞的增殖，促进了纤维组织的增生。本研究对肝癌细胞另一个生物活性因子TGFβ1进行基因沉默，使肝癌组织低表达TGFβ1因子，BMSC经对具有高低转移潜能肝癌肿瘤动物模型进行干预实验结果显示，对低转移潜能肝癌(MHCC97-L)肿瘤的体积及重量均有促进作用，相应的病理结果显示有较多坏死区、较多肿瘤细胞凋亡、坏死。而BMSC对高转移潜能肝癌(MHCC97-H)肿瘤的体积和肿瘤重量具有明显的抑制作用，病理结果显示经TGFβ1沉默组肿瘤中纤维组织增生明显，可以解释对肿瘤体积和瘤重的促进作用，这也表明TGFβ1具有促进肿瘤细胞增殖的作用，经基因沉默后，促进肿瘤细胞增殖作用减弱，取而代之纤维组织增生明显，这与文献报道的TGFβ1功能相一致[9]。

分子生物学研究表明，TGFβ1、OPN与整合素αvβ3之间存在明显的关系，整合素与细胞外基质(ECM)黏附的过程中，OPN介导作用机制，TGFβ1通过上调整合素关联蛋白激酶(Integrin-linked kinase, IKL)的表达而激活蛋白激酶B这一信号通路，TGFβ1提高黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)酪氨酸的磷酸化水平，激活下游的信号分子直接或间接地影响肝癌侵袭和转移[10]。

BMSC对肿瘤的干预效能存在不同的研究结果[2]，这种差异可能与肿瘤微环境有关，多种因子可能参与BSMC对肿瘤的干预。本研究中TGFβ1、OPN两种生物因子参与了肿瘤的增殖和转移，通过对两种因子的抑制，BMSC干预效能出现差异，抑制肿瘤OPN表达BMSC可更好地抑制肿瘤的增殖，而抑制肿瘤TGFβ1表达BMSC并不能抑制肿瘤的增殖。由此可见，相应的抗体沉默OPN可能是治疗肿瘤的一个比较好的靶点，配合BMSC生物治疗会提高治疗的生物效能。

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(责任编辑：王全楚)

Effect of BMSC on hepatocellular carcinoma tissues by gene interference

LI Tianran1, HUANG Xiaobin2, SONG Bin2, LU Guangming3, LI Yanjun3

1. Department of Radiology, 304th Hospital of Chinese PLA, Beijing 100048; 2. Department of Radiology, 95th Hospital of Chinese PLA; 3. Department of Radiology, Nanling General Hospital of Chinese PLA, China

Objective To observe the effect of BMSC on hepatocellular carcinoma (HCC) with different metastatic potential by gene interference.Methods Sixty-three nude mice were randomly divided into eight groups, including MHCC97-L blank control group (9 nude mice), MHCC97-L gene negative control group (8 nude mice), MHCC97-L OPN gene interference group (8 nude mice), MHCC97-L TGFβ1 gene interference group (5 nude mice )and MHCC97-H blank control group (8 nude mice), MHCC97-H gene negative control group (8 nude mice), MHCC97-H OPN gene interference group (9 nude mice), MHCC97-L TGFβ1 gene interference group (8 nude mice). When tumor volume grown to 50 mm3, human mesenchymal stem cells (BMSC) was injected, and 1×105/one, two times a week, for 4 weeks. Tumor volume inhibition rate (%) and tumor weight inhibition rate (%) were calculated, and pathological test was used for HCC animal model with gene silencing.Results Compared with the MHCC97-L blank control group, BMSC could promote the tumor volume and tumor weight of MHCC97-L NC group, and could inhibit tumor volume and tumor weight of MHCC97-L OPN gene interference group. However, BMSC could promote the tumor volume and tumor weight of MHCC97-L TGFβ1 gene interference group. Compared with the MHCC97-H blank control group, BMSC could mildly inhibit the tumor and tumor weight of MHCC97-H gene negative control group, and could inhibit tumor volume and tumor weight of MHCC97-H OPN and TGFβ1 gene interference groups. Compared with MHCC97-H blank control group and MHCC97-H gene negative control group, the fiber proliferation and nuclear division of MHCC97-H OPN gene interference group were less, while the MHCC97-H TGFβ1 gene interference group had obvious fiber hyperplasia and more nuclear division. Compared with MHCC97-L blank control group,MHCC97-L gene negative control group, MHCC97-L OPN gene interference group and MHCC97-L TGFβ1 gene interference group could see more necrotic areas, more tumor cell apoptosis, necrosis, and can be seen a number of mitotic figures.Conclusion Inhibition of tumor OPN expression BMSC may be better able to inhibit tumor proliferation, while inhibition of tumor TGFβ1 expression BMSC did not inhibit tumor proliferation. The corresponding antibody silencing OPN may be a good target for the treatment of tumors, the BMSC biological treatment will improve the biological efficacy of treatment.

HCC; BMSC; Metastasis; OPN; TGFβ1

国家自然科学基金资助项目( 81271607) ;南京军区医药卫生重点项目资助(11Z035); 国家博士后基金(2015M572810)

李天然，博士，2012 年北京大学医学部博士后，副主任医师，研究方向：肝癌分子影像学研究。E-mail: lizhaoruixin@sina.com

宋斌，E-mail: ltranmd@yeah.net

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.08.005

论著·肝癌

R735.7

A

1006-5709(2016)08-0860-05

2016-01-11