pH、GSH双敏感型胶束的制备及其载药性能研究*

余丽丽，姚 琳，苏 力，丁淑梅，田洪玉

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

聚合物胶束作为药物载体的一个重要优势是可在亲水段或疏水段引入各种敏感性基团(pH[1]、温度[2]、氧化还原[3]、光[4]等)，以构建刺激响应型药物载体。

pH 敏感型聚合物胶束是目前研究较为广泛的一种刺激响应型药物载体，该类载体的设计主要是基于肿瘤细胞附近组织液的pH值比正常组织处低这一显著特点[5]。因此通过聚合物胶束的酸敏感设计有望实现抗癌药物在肿瘤组织处靶向释放。如Kataoka等[6]利用腙键将抗癌药物阿霉素(DOX)连接到胶束的疏水段。

谷胱甘肽(GSH)是生物体内的一种抗氧化剂，在细胞内外的浓度差异巨大[7]，二硫键在由GSH提供的还原环境中会发生断裂生成巯基[3]，因此二硫键常被引入到胶束的结构设计中以实现药物的GSH敏感性释放。

据此，作者通过原子转移自由基聚合(ATRP)在两亲聚合物结构中引入具有酸敏感性的甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(DEAM)单体和含二硫键的交联剂(CL)，合成具有pH-GSH双重敏感性的两亲性聚合物PEG-PDEAM-CL。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

双(2-羟基乙基)二硫醚：质量分数为98%，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)；甲基丙烯酰氯：质量分数为95%、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(DEAM)：质量分数为99%、五甲基二乙烯基三胺(PMDETA)：质量分数为99%、溴化亚铜(CuBr)：质量分数为99%、中性氧化铝：AR、均为阿拉丁试剂；聚乙二醇单甲醚-1900：质量分数为98%、2-溴-2-甲基丙酰溴：质量分数为97%，阿法埃莎中国化学有限公司；氯仿-d：质量分数为99.8%，广州希凯生物科技有限公司；1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)：质量分数为98%，北京伊诺凯科技有限公司；L-还原型谷胱甘(GSH)：质量分数为99%，上海源叶生物科技有限公司；四氢呋喃(THF)用CaH2重蒸。

旋转蒸发仪：RE-2000A，巩义市予华仪器有限责任公司；集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S，巩义市予华仪器有限责任公司；电热鼓风干燥箱：101-O，北京科伟永兴仪器有限公司；紫外可见分光光度计：UV-2102 PCS，上海尤尼柯上海仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 PEG-PDEAM-CL的合成及表征

根据文献制备聚合物合成所需要的交联剂(CL)[8]和引发剂(PEG-Br)[9]。

以DEAM(4.957 mmol)为单体，PEG-Br(0.1 mmol)为引发剂，PMDETA(0.435 mmol)为配体，CuBr(0.145 mmol)为催化剂，CL(0.5 mmol)为交联剂，甲醇(5 mL)为溶剂，通过ATRP聚合反应合成PEG-PDEAM-CL，见图1。

图1 PEG-PDEAM-CL的合成

具体步骤如下：在反应管中依次加入引发剂、配体、催化剂、交联剂、溶剂、磁子，密闭瓶口。真空泵抽气，充氮气(多次重复操作)。在氮气的保护条件下，用注射器加入单体DEAM，油浴60 ℃反应20 h。反应结束后，产物以二氯甲烷(DCM)为洗脱剂过中性氧化铝柱，收集洗脱液，40 ℃浓缩。少量DCM溶解，在冰浴下加入10 mL 石油醚(PE)沉降，收集沉淀。35 ℃干燥，得产物PEG-PDEAM-CL。称取5 mg PEG-PDEAM-CL，氯仿-d溶解后1H-NMR表征。

1.2.2 PEG-PDEAM-CL胶束的CMC值的测定

以THF为溶剂配制1 mg/mL的聚合物母液和5×10-2mmol/mL DPH母液。

取9个棕色小瓶，加入50 μL DPH母液，分别加入20、50、100、300、400、500、600、800 μL的聚合物母液，添加THF至1 mL。搅拌10 min后缓慢滴加5 mL pH=8.0的缓冲液(20 mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，简称缓冲液)，搅拌30 min后，过0.45 μm微孔滤膜，40 ℃浓缩至2 mL。得到聚合物质量浓度分别为10、25、50、150、200、250、300、400 μg/mL的溶液。在200～600 nm扫紫外全波，确定λmax，并以吸光度(A)为纵坐标，聚合物质量浓度(ρ)为横坐标作图确定CMC。

1.2.3 DOX标准曲线的绘制

以去离子水为溶剂，配制5、10、15、20、30、40 μg/mL的不同质量浓度的DOX水溶液，在485 nm波长下测其A，并以质量浓度为横坐标，A值为纵坐标绘制DOX标准曲线。

1.2.4 聚合物胶束的制备

溶液1：将20 mg聚合物溶于1 500 μL 的THF和500 μL的二甲基甲酰胺(DMF)混合溶剂中；

溶液2：将2.5 mg DOX溶于500 μL的DMF中，再向体系中滴入2滴三乙胺(TEA)；

溶液3：将溶液2加入到溶液1中，搅拌30 min。

将溶液3在磁力搅拌条件下缓慢的滴加至7.5 mL pH=8.0的缓冲液，搅拌1 h，减压蒸馏除去THF。用250 mL pH=8.0的缓冲液透析除去游离的DOX，每1 h换一次透析液，透析6 h后，将样品定容至20 mL，即为载药胶束样品。

1.2.5 胶束的药物包封率和载药量的测定

取0.5 mL的载药胶束40 ℃减压蒸馏除去溶剂，加入2 mLV(DMSO)∶V(DCM)=1∶1的混合溶剂，超声溶解30 min。在485 nm波长下测其吸光度值。计算载药胶束的包封率及载药量。

(1)

(2)

1.2.6 载DOX胶束的体外释药研究

取载药胶束4 mL于透析袋内，放入20 mL透析液内，在37 ℃下进行药物释放。间隔时间取2 mL透析液测定485 nm处吸光度，并补充空白透析液2 mL。因DOX为疏水性药物，故释药所用透析液均需加吐温60增溶，每20 mL透析液加125 μL 吐温60。

(1) pH值响应药物释放特性研究

以pH=2.2、5.0、7.4 三种缓冲液作为释放介质，考察载药胶束的释药动力学过程。

(2)c(GSH)响应药物释放特性研究

以c(GSH)=0、0.02、5 mmol/L三种缓冲液作为释放介质，考察载DOX胶束的释药动力学过程。

2 结果与讨论

2.1 PEG-PDEAM-CL的1H-NMR图谱分析

PEG-PDEAM-CL的1H-NMR图谱见图2。

δ图2 PEG-PDEAM-CL的1H-NMR图谱

其中约3.59～3.72，4.16，1.86的信号分别归属于PEG结构中的—CH2CH2O—，—CH2O—，以及通过2-溴异丁酰溴引入的CH3—，PEG结构中CH3O—信号被覆盖于—CH2CH2O—信号下，约2.65～2.78的信号归属于单体结构中的—NCH2CH2O—，约2.73的信号归属于单体结构中的—NCH2CH2O—和交联剂结构中的—OCH2CH2S CH2CH2SCH2CH2O—，约0.93～1.32的信号则归属于单体结构中5，6，8碳上的氢和交联剂结构中的9碳上的氢。

2.2 聚合物胶束CMC值的确定

聚合物胶束的CMC值的确定见图3。

ρ(聚合物)/(μg·mL-1)图3 聚合物的CMC值的确定

载DPH聚合物胶束的λmax=262 nm，从图3中可以看出，在262 nm波长下，吸光度值在ρ(聚合物)=88.24 μg/mL处，有较大的转折，所以此浓度即为该聚合物胶束的CMC值。

2.3 DOX的标准曲线

DOX的标准曲线见图4。

ρ(DOX)/(μg·mL-1)图4 DOX的标准曲线

由图4可以得出DOX标准曲线的回归方程为A=0.021 6-0.004 9，R2=0.999 3，说明ρ(DOX)=5～40 μg/mL，线性良好，可以进行定量分析。

根据DOX标准曲线，及公式(1)、(2)计算出最大载药量为8.78%，相应的包封率为70.26%。

2.4 载药胶束的体外释药性能

2.4.1 pH值对载DOX胶束的释放特性的影响

载DOX胶束在不同pH值环境中的释药曲线见图5。

t/min图5 载药胶束在不同pH值环境中的释药曲线

由图5可以看出，在不同pH值环境中，载药胶束中的DOX释放均呈上升趋势，且在pH=2.2的透析液中释放最好，12 h累积释药率可达100%，pH=5.0次之，pH=7.4最小。在正常组织或血液中，细胞液的pH≈7.4，从图5中可知，在pH=7.4的环境下，4 h的释药率不到30%，说明该载药胶束在正常组织中，稳定性较好。从不同pH值环境下释药的情况来看，环境酸度越高，释药率越大，说明在酸性条件下载药胶束释药速度大于在碱性条件下的释药速度。这是由于载DOX胶束中含有叔胺基团，具有酸敏性，在酸性条件下，胶束尺寸会明显增大，进而导致其对DOX的释放速度大大加快。

2.4.2 c(GSH)对载药胶束的释放特性的影响

载药胶束在不同浓度GSH环境中的释药曲线图见图6。

由图6可见，在不同GSH浓度环境中，载药胶束中的DOX释放均呈上升趋势，且在c(GSH)=5 mmol/mL环境下的释药性能最好，12 h累积释药率可达100%，在c(GSH)=0.02 mmol/mL环境下的释药性能次之，不含GSH的环境中释药性能最差。说明载药胶束在较高浓度GSH条件下的释药速度大于在较低浓度GSH的条件下的释药速度。这是由于聚合物胶束结构中含有二硫键，在还原环境中二硫键发生断裂转变成巯基，胶束结构重新组装促使 DOX 快速地从胶束中释放出来。

t/min图6 载药胶束在不同c(GSH)环境中的释药曲线

3 结 论

(1) 通过ATRP反应合成具有pH-GSH双重敏感性的两亲性聚合物PEG-PDEAM-CL，通过1H-NMR对其结构进行了表征；

(2) 采用透析法将DOX载入聚合物胶束，测定其最大载药量为8.78%，包封率为70.26%；

(3) 并在不同pH(pH=2.2、5.0、7.4)环境条件及不同c(GSH)下(0、0.02、5 mmol/L)进行体外释药实验，研究两种响应行为对药物控制释放的协同作用。研究发现，载DOX聚合物胶束在酸性条件下及高浓度的GSH条件下释放速率较快，具有pH-GSH双重敏感性。

参 考 文 献：

[1] 尤静,余丽丽,姚琳,等.酸敏感型两亲性聚合物的制备和释药性能研究[J].化工新型材料,2014,42(01):40-42.

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