GSK3β、CXCR4、MMP-2与胰腺癌侵袭和转移的关系

许 莹，潘振国，李倩君，潘 峰，吴 健

南京医科大学附属淮安第一医院1.消化内科; 2.病理科， 江苏 淮安 223300

GSK3β、CXCR4、MMP-2与胰腺癌侵袭和转移的关系

许 莹1，潘振国1，李倩君1，潘 峰1，吴 健2

南京医科大学附属淮安第一医院1.消化内科; 2.病理科， 江苏 淮安 223300

目的 研究GSK3β、CXCR4、MMP-2在人胰腺癌组织及癌旁组织中的表达，探索三者与胰腺癌转移、侵袭的关系。方法 采用免疫组化法检测人胰腺癌及癌旁组织标本中GSK3β、CXCR4、MMP-2的表达，采用Real-time PCR检测胰腺癌癌组织及癌旁组织中GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA的表达。结果 GSK3β、CXCR4、MMP-2在胰腺癌组织中的阳性表达均明显高于癌旁组织(P<0.05)，胰腺癌患者癌组织中GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA表达均明显高于癌旁组织(P<0.05)。并且三者在癌组织阳性表达均与患者是否存在淋巴结转移有相关性(P<0.05)。结论 GSK3β、CXCR4、MMP-2三者在胰腺癌组织中高表达，且都和胰腺癌患者淋巴结转移有关。

胰腺癌；GSK3β；CXCR4；MMP-2

胰腺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，起病隐匿、发展迅速、预后极差[1-2]，未经治疗者1年生存率约20%，5年生存率不到4%。在我国，胰腺癌发病率呈逐步上升趋势，已成为严重危害我国人口健康的恶性肿瘤。肿瘤的发生转移是多基因引起的，因此深入研究和胰腺癌发生转移有关的相关指标，可以为胰腺癌的治疗提供新的理论依据。相关研究表明GSK3β、CXCR4、MMP-2与细胞增殖有关[3]，且在多种肿瘤组织内高表达，目前未有关于GSK3β、CXCR4、MMP-2三者在胰腺癌中的研究，因此我们推测三者在胰腺癌中可能高表达，可能与胰腺癌转移有关。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集南京医科大学附属淮安第一医院2011年-2014年手术切除并确诊为胰腺癌的77例标本，其中男51例，女26例，年龄41岁～75岁，平均年龄(58±5)岁，胰腺癌的临床分期按2002年国际抗癌联盟制定的TNM分期法进行[4]，对照组为上述77例标本中15例癌组织边界≥1 cm的癌旁组织。

1.2 主要试剂 GSK3β鼠抗人单克隆抗体及MMP-2 兔抗人单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)。兔抗人CXCR4 多克隆抗体购自Abcam公司、DAB 显色试剂盒及 SP 免疫组化试剂盒(博士德生物工程有限公司)。Trizol﹑逆转录试剂盒﹑RNasin﹑SYBR Green(购自Invitrogen公司)，内参β-actin和目的基因引物由Invitrogen公司合成。

1.3 实验步骤 免疫组化步骤：(1)组织标本常规脱蜡脱水。(2)阻断灭活内源性过氧化物酶：3%过氧化氢孵育，PBS冲洗3次，5 min/次。(3)抗原修复，放入枸橼酸缓冲液(pH<6.0)中煮沸(95 ℃)15～20 min，自然冷却，PBS冲洗3次，5 min/次。(4)5% 正常山羊血清(PBS 稀释)封闭，室温孵育 10 min后滴加 一抗，4 ℃ 过夜。(5)PBS冲洗3次，每次5 min(用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照)，滴加生物素标记二抗孵育，PBS冲洗冲洗3次，每次5 min。(6)滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液孵育，PBS冲洗冲洗3次，每次5min。(7)DAB染色，自来水冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

Real-time PCR步骤：(1)GSK3β、CXCR4、MMP-2的阳性标本为手术切除的胰腺癌组织，对照组为癌组织边界1 cm以上切除的癌旁组织。(2)Trizol法提取细胞的总RNA，在-80 ℃冰箱中取出癌组织及癌旁组织标本，每个标本加入Trizol后匀浆器匀浆后放入相应标号的EP管中，并标记好。(3)充分混匀后，每个EP管中加入氯仿后12 000 r/min,离心15 min。(4)小心的取出(3)中离心后的上层水相，放入新编号的EP管中，(不要全部将上层水相取出，宁少勿多)。(5)加入异丙醇至(4)中的EP管中，轻轻混匀，在-20 ℃冰箱中放置1 h。(6)离心10 min后，弃去上清液，缓慢地沿EP管壁加入预冷的75%乙醇，7 500 r/min,离心10 min，弃去上清，EP管倒置放干燥,然后用无菌ddH2O溶解。(7)逆转录及Real-time PCR 反应检测NS和18 sRNA的表达，按照逆转录试剂盒的说明步骤进行逆转录，逆转录完毕后上机进行目的基因和内参β-actin的扩增反应。

1.4 结果判定[5]根据阳性细胞百分比及染色强度进行综合评分并做半定量分析，着色强度积分：所计数细胞无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，每张切片随机取10个高倍视野，然后将10个视野的积分之和除以10，结果以四舍五入取整数作为细胞染色强度积分，然后再对每张切片的染色细胞数进行积分，每个视野按白细胞计数法计数100个细胞，阳性细胞所占百分比：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分，两项评分相加，以0～1分作为切片阴性(-)，≥2分为阳性(+)，3～4分为中等阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。

1.5 统计学处理 采用 SPSS 19.0 进行统计学分析，以χ2检验进行定性资料的分析，以t检验进行配对资料的分析，相关性分析采用 Spearman, srhotest 进行分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织及癌旁组织GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA表达 胰腺癌患者癌组织GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA的表达明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 癌组织及癌旁组织GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA表达图

Fig 1 Expression of GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA in pancreatic cancer and adjacent to cancer tissue

2.2 GSK3β、CXCR4、MMP-2与胰腺癌侵袭和转移的关系 GSK3β在细胞质表达，阳性染色为细胞质中出现棕色或棕黄色颗粒(见图2)，CXCR4的阳性细胞为包浆或包膜着色，染色为棕黄色，在胰腺导管及腺泡中均有表达，在间质组织中无表达(见图3)；MMP-2主要在胞浆中表达。GSK3β、CXCR4、MMP-2在胰腺癌组织中的阳性表达明显高于癌旁组织(P<0. 05，见表1)。GSK3β、CXCR4、MMP-2阳性表达在胰腺癌患者、是否有淋巴结转移差异有统计学意义(P<0.05，见表 1)，而在性别及年龄方面差异无统计学意义P>0.05，见表1)。

图2 GSK3β的表达情况(SP 100×); 图3 CXCR4的表达情况(SP 100×); 图4 MMP-2的表达情况(SP 100 ×) A:胰腺癌组织；B：癌旁组织

Fig 2 The expression of GSK3β(SP 100×); Fig 3 The expression of CXCR4(SP 100×); Fig 4 The expression of MMP-2(SP 100×) A: pancreatic cancer, B: adjacent to cancer tissue

表1 胰腺癌患者GSK3β、CXCR4、MMP-2的表达与临床特征的关系

Tab 1 Relationship between the expression of GSK3β，CXCR4，MMP-2 and clinical features in pancreatic cancer

GSK3β+++/++/+-P值CXCR4+++/++/+-P值MMP⁃2+++/++/+-P值是否有淋巴结转移 有转移428<0．05307<0．054014<0．05 无转移141324161112性别 男2811>0．053210>0．053018>0．05 女38102213218年龄(岁) >503812>0．053014>0．053717>0．05 <50189249149组别 癌组织509<0．05379<0．05407<0．05 癌旁组织61217141119

2.3 采用 Spearman, srhotest方法检测GSK3β、CXCR4、MMP-2三者之间的相关性分析 GSK3β阳性表达与CXCR4 阳性表达呈正相关(r=0.140，P<0.05，见表2)，GSK3β阳性表达与MMP-2阳性表达正相关(r=0.144，P<0.05，见表3)，CXCR4阳性表达与MMP-2阳性表达正相关(r=0.156，P<0.05，见表4)。

表2 GSK3β表达与CXCR4表达的相关性

Tab 2 The correlation between expressions of GSK3β and CXCR4

CXCR4+++/++/+CXCR4-r值P值GSK3β+++/++/+46100．429<0．05GSK3β-813

表3 GSK3β表达与MMP-2表达的相关性

Tab 3 The correlation between expressions of GSK3β and MMP-2

MMP⁃2+++/++/+MMP⁃2-r值P值GSK3β+++/++/+41150．249<0．05GSK3β-1011

表4 CXCR4表达与MMP-2表达的相关性

Tab 4 The expression correlation of CXCR4 and MMP-2

MMP⁃2+++/++/+MMP⁃2-r值P值CXCR4+++/++/+42120．374<0．05CXCR4-914

3 讨论

胰腺癌是目前威胁人类健康的恶性肿瘤之一，目前发病率呈上升趋势，胰腺癌起病隐匿，早期临床表现缺乏特异性，且病情发展较迅速，死亡率较高[1]，病死率已居于恶性肿瘤的第4位[2]，大多数患者确诊胰腺癌已属于晚期，及早的发现诊治对胰腺癌患者尤为重要，但由于目前缺乏相对有效地治疗方案[6]，积极的探寻胰腺癌发展及转移的机制较重要。

GSK3β是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它可以调节多种肿瘤细胞的糖代谢、细胞增殖与凋亡[7-8]，通过抑制GSK3β的表达，细胞可以发生EMT[9-10]，而EMT与肿瘤的发生发展有一定关系，研究发现GSK3β与肿瘤的侵袭及发展有一定的关系，本研究与发现胰腺癌癌组织GSK3β表达明显高于癌旁组织，这与以往的研究相符合。趋化因子(chemokine)是一个细胞因子超家族，它在多种生理或病理过程中发挥重要作用。目前已发现多种趋化因子和受体[11]，CXCR4 是其中一个受体，目前发现多种肿瘤如肝癌表达CXCR4，并且发现CXCR4的表达量与肿瘤患者的预后有明确的关系[11-13]，相关研究也表明趋化因子与其受体CXCR4的相互作用和肿瘤的转移进展有相关性[14-16]，MMP-2被认为能够溶解细胞外基质，从而促进了肿瘤细胞的转移。MMP-2它可以降解Ⅳ型胶原蛋白，在多种肿瘤组织中高表达，且与肿瘤的远处转移有一定的关系[17-18]。

GSK3β、CXCR4、MMP-2三者已经被证实与细胞的增殖有关，且在多种肿瘤组织内表达[3]，但目前暂未有在胰腺癌患者组织标本表达情况的相关研究，本研究显示GSK3β、CXCR4、MMP-2三者的表达均明显高于癌旁组织，且三者的的阳性表达与患者的性别、年龄无显著性差异，但均与肿瘤患者是否淋巴转移有明显的相关性，认为GSK3β、CXCR4、MMP-2三者的含量高低与胰腺癌是否远处转移有一定的关系，这与以前其他肿瘤的相关研究[19]相吻合，进一步我们采用Spearman方法进行相关性分析后发现，GSK3β、CXCR4、MMP-2三者之间均存在正相关，我们推测可能存在GSK3β、CXCR4、MMP-2三者的信号通路，进而影响胰腺癌远处转移，我们下一步试验将就三者之间的信号通路方面进行研究，以期胰腺癌的转移机制提供更多的理论基础。

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(责任编辑：李健)

Relationship of invasion and metastasis of pancreatic cancer with GSK3β, CXCR4 and MMP-2

XU Ying1, PAN Zhenguo1, LI Qianjun1, PAN Feng1, WU Jian2

1.Department of Gastroenterology; 2.Department of Pathology, Huai’an First People’s Hospital, Nanjing Medical University, Huai’an 223300, China

Objective To investigate the expressions of GSK3β, CXCR4 and MMP-2 of pancreatic cancer and adjacent to cancer tissue, and explore the relationship of GSK3β, CXCR4, MMP-2 with invasion and metastasis of pancreatic cancer.Methods The expressions of GSK3β, CXCR4 and MMP-2 of pancreatic cancer and adjacent to cancer tissue were detected by immunohistochemistry techonology. The mRNA expressions of the three genes of pancreatic cancer and adjacent to cancer tissue were detected by Real-time PCR.Results The expressions of GSK3β, CXCR4 and MMP-2 in pancreatic cancer tissue were significantly higher than those in adjacent to cancer tissue both in gene and protein (P< 0.05), and they were significantly related with lymph node metastasis and clinical stage (P<0.05).Conclusion The expressions of GSK3β, CXCR4 and MMP-2 in pancreatic cancer tissue are high, and they have a relattionship with lymph node metastasis.

Pancreatic cancer; GSK3β; CXCR4; MMP-2

许莹，主治医师，硕士研究生，研究方向：胰腺癌的转移机制。E-mail: xinying1318@163.com。

潘峰，主任医师，医学博士，硕士研究生导师，研究方向：胰腺癌的转移机制。E-mail: fengliupan@126.com。

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.027

R735.9

A

1006-5709(2016)11-1308-04

2016-01-18