短期DC-CIK生物免疫疗法治疗中晚期食管癌患者的疗效观察

奚小祥, 陈　浩

(1. 江苏省泰兴市人民医院 胸外科, 江苏 泰兴, 225400; 2. 南京德塔生物技术有限公司, 江苏 南京, 210004)



短期DC-CIK生物免疫疗法治疗中晚期食管癌患者的疗效观察

奚小祥1, 陈浩2

(1. 江苏省泰兴市人民医院 胸外科, 江苏 泰兴, 225400; 2. 南京德塔生物技术有限公司, 江苏 南京, 210004)

关键词:DC-CIK; 食管癌; 淋巴细胞亚群

食管癌是一种最具侵袭性的肿瘤，其微小转移灶难以发现并清除，患者整体预后及疗效不佳[1-2]。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)具有高增殖能力和高细胞毒性，对恶性肿瘤有疗效。树突状细胞(DC)是目前已知的最强的抗原提呈细胞(APC)，它能够显著地刺激初始型T细胞增殖，在肿瘤免疫治疗中起着重要的作用[3]。本研究探讨DC-CIK治疗中晚期食管癌患者的疗效，现报告如下。

1资料与方法

1.1临床资料

选取2013年1月—2015年12月泰兴市人民医院肿瘤科采用DC-CIK治疗的食管癌患者28例，年龄48～86岁，中位年龄67岁，KPS评分>70分。入选标准: ① 确诊为恶性肿瘤患者; ② 卡氏评分大于60分; ③ 预计生存期大于6个月; ④ 重要生命器官正常。排除标准: ① 骨髓、心、肝、肾、肺等重要器官功能严重衰竭者; ② 脏器移植者; ③ 怀孕或正在哺乳的妇女; ④ 阻碍签署知情同意者; ⑤ 严重自身免疫性疾病。28例患者中，男24例，女4例；年龄49～86岁；肿瘤分期为II期10例，III期11例，IV期7例；接受过手术+化疗3例，手术11例，放疗2例，化疗6例，未接受治疗6例；转移部位有肝转移3例，纵膈淋巴结转移3例，肺转移7例，淋巴结转移4例，淋巴结及肝转移1例，肝脾转移1例，心脏淋巴结转移2例，肺淋巴结转移4例，喉淋巴结转移1例，肺及脑膜转移1例，无转移1例。

1.2主要试剂和仪器

细胞培养箱、离心机、RPMI-1640培养基(WISENT 公司)、Ficoll(上海华精生物高科技有限公司)、rhIL-4(Peprotech公司)及GM-CSF (Peprotech公司)、rhIL-1(Peprotech公司)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)(Peprotech公司)、CD3单抗(Peprotech 公司)、干扰素-γ(IFN-γ)(Peprotech 公司)、rhIL-1、rhIL-2(Peprotech公司)。

1.3DC-CIK细胞治疗方法

1.3.1DC-CIK制备及回输流程：DC-CIK细胞制备。28例患者在术后第2周人工采集患者外周血100～150 mL，常规 Ficoll分离外周血单个核细胞(PBMC)，经洗涤、离心收集纯化的 PBMC，进行贴壁分离RPMI-1640培养基培养，分别诱导DC及CIK的活化。DC培养基30 mL，添加细胞因子rhIL-4及GM-CSF，第5天添加 rhIL-1及TNF-α诱导成熟，第7天收获 DC 刺激 CIK。CIK 培养基 30 mL，调整细胞密度3 M/mL，抗人CD3单抗(包被液处理)，添加IFN-γ、rhIL-1、rhIL-2进行诱导活化，后期添加 rhIL-2 进行增殖扩瓶。将培养8～10 d的细胞离心、洗涤、收获，取部分细胞进行细菌、霉菌的检测，然后按每次6×108～8×108的量溶于100 mL生理盐水中，2 h内回输至患者体内，每天回输1次，连续5次为1个疗程。

1.3.2DC-CIK细胞质量控制：除严格控制细胞制备过程外，作者采用以下指标对细胞进行质量检验: ① 细胞数量控制; ② 细胞存活率控制; ③ 细胞表型检测; ④ 内毒素检测。

1.3.3术后、化疗及DC-CIK的综合治疗方案：3例患者在术后第2周采取外周血100～120 mL

用于DC-CIK细胞的体外培养和扩增，1周后回输患者体内，术后第4周行第1周期化疗。其后序贯进行第2、3周期的化疗。11例患者术后2周采集外周血100～120 mL用于DC-CIK 细胞治疗。8例患者在DC-CIK细胞回输1周后进行同期放化疗。

1.4疗效评价

临床疗效按RECIST标准分为CR、PR、SD、PD。以CR+PR计算客观缓解率(ORR), CR+PR+SD计算疾病控制率(DCR)。患者接受免疫治疗后的1个月进行原病灶及转移灶CT扫描等检查来评估疾病治疗状况。记录患者出现的不良反应。分别于患者抽血前和DC-CIK回输1周及1个月后抽取外周血2 mL(抗凝血)，流式细胞仪检测患者外周血淋巴细胞免疫细胞CD3+、CD4+、CD16+CD56+、TH/TS。观察患者治疗前后血常规、肝、肾功能变化。

2结果

28例患者经DC-CIK联合治疗后，CR 0例，PR 12例，SD 9例，PD 7例，ORR为43%，DCR为75%。DC-CIK治疗后，1例患者影像学检查显示原发灶和转移灶明显减少，未见高代谢肿瘤残存症状。

DC细胞表面有树突状突起，随着成熟诱导，其表面突起愈加明显，将成熟DC与CIK按1∶10混合培养。倒置显微镜下清晰可见漂浮DC-CIK细胞，细胞体积增大，透明，折光性强，形态不规则，且培养后期细胞密度增大，形态呈椭圆形。细胞制剂临床达109数量级，台酚蓝染色活细胞比例>90%，微生物培养阴性，内毒素检查阴性，上清肝炎、梅毒、HIV抗体检测均为阴性。

CD3+、CD4+比例在DC-CIK治疗后有所上升；CD16+CD56+治疗后及1个月后较治疗前显著升高(P<0.05)；治疗后TH/TS较治疗前显著降低(P<0.05)，1个月后其数值较治疗前、治疗后显著增加(P<0.05)。见表1。28例患者在治疗过程中均未出现发热、呕吐等不良反应，治疗前后血常规、肝、肾功能检测指标均无明显变化。

表1　28例患者治疗前后淋巴T细胞亚群变化比较

与治疗前比较, #P<0.05; 与治疗后比较, *P<0.05。

3讨论

据国际癌症机构[4]统计，全世界每年有1 410万例新发癌症病例，802万例死亡，而食管癌成为世界癌症患者死亡的主要因素之一。食管癌主要的治疗方法是手术或者联合放化疗治疗方案，且预后生存率较差，5年生存率仅为23.1%[5]。细胞免疫治疗日趋活跃，DC细胞即树突状淋巴细胞，是正常人体内存在的一种具有抗原提呈功能的特殊细胞，能够直接摄取、加工和呈递抗原，刺激体内初始型T细胞活化，调控机体免疫应答。CIK细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤广、识别能力强等诸多特性[6]。由树突状细胞(DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)构成的DC-CIK治疗是近年来兴起的免疫治疗方案，具有高效、低毒的特性，是恶性肿瘤免疫治疗的首选方案[3]。DC、CIK共培养可以相互作用，DC能够分泌大量IL-2因子，同时CIK分泌CD3+CD56+也显著增加，可见DC可以促进CIK细胞的成熟，增强CIK细胞毒性；CIK还能够促进DC分泌CD80+CD86+等共刺激因子，增强肿瘤的免疫应答。CIK还能够表达IFN-γ和TNF-α，进一步提高免疫应答效率，改善患者的睡眠状况，从而减轻患者的抑郁状态，提高患者的生活质量[7-9]。Sadanga等[10]应用DC治疗胃肠道肿瘤患者，发现DC能够明显降低患者食管癌块体积，具有较强的抑制作用。

本研究应用DC-CIK治疗中晚期食管癌患者，以淋巴细胞亚群评估治疗效果。研究发现，28例患者治疗1周后检查结果TH/TS范围显著降低，1个月后复查数值恢复至正常值，并较之前检查结果显著升高；CD16+CD56+治疗后检查结果较治疗前均显著上升，与既往临床研究[6-7]结果一致。Schmidt等研究[11]报道，DC诱导培养CIK可以使CIK细胞中的免疫抑制T细胞，即Treg细胞明显降低，削弱其对抗肿瘤免疫细胞的抑制作用，增强CIK对肿瘤的杀伤效应。本研究证实了治疗后NKT细胞显著升高，体现DC-CIK对肿瘤细胞的杀伤作用，且毒副作用较低。然而，治疗后1周TH/TS值较治疗前显著降低，1个月后比值大幅度升高，CD3+、CD4+均未出现明显变化，与既往研究[12-13]有所不同，但从另一角度反映机体出现免疫应答，患者免疫机制有所改善[14]。有研究[15]显示，术前DC-CIK联合化疗治疗食管癌后，患者癌组织中Ras、Raf、MEK、P38、c-Met等肿瘤生成和转移因子均显著降低，其中原癌基因c-Met能够促进血管生成，Raf激活ERK诱导细胞发生恶性增殖，揭示了DC-CIK对癌症治疗的意义。

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中图分类号:R 735.1

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)09-116-02

DOI:10.7619/jcmp.201609033

收稿日期:2016-01-16