远隔缺血时处理对心脏瓣膜置换术心肌微小RNA表达及心肌细胞凋亡的影响

邢　杰　谢　霆　吴朝光

(海南省人民医院心脏外科，海南　海口　570311)



远隔缺血时处理对心脏瓣膜置换术心肌微小RNA表达及心肌细胞凋亡的影响

邢杰谢霆吴朝光

(海南省人民医院心脏外科，海南海口570311)

〔摘要〕目的探讨远隔缺血时处理对心脏瓣膜置换术心肌微小RNA表达及心肌细胞凋亡的作用。方法心胸外科择期行体外循环下心脏瓣膜置换手术的风湿性心脏瓣膜病患者60例按照随机数字表法分为远隔缺血时处理组和对照组，每组30例。两组均给予心脏瓣膜置换手术，其中远隔缺血时处理组在阻断主动脉后立即实施下肢缺血/再灌注处理。 对照组放置止血带但不进行充气。分别在体外循环开始前及主动脉阻断钳开放后5 min内剪取右心耳组织作为检测标本。实时定量聚合酶链反应(PCR)技术检测和验证miR-1，miR-21，miR-24和miR-195的表达情况，并采用TUNEL法检测心肌组织心肌细胞凋亡情况。结果远隔缺血时处理组中miR-1和miR-195的表达较对照组降低明显(P<0.05)，miR-24和miR-21的表达与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。在翻译水平，远隔缺血时处理组的Bcl-2的mRNA表达比对照组显著上调(P<0.05)，而BAX，PDCD4的mRNA的表达则无明显改变。心肌缺血前远隔缺血时处理组和对照组心肌凋亡细胞数目较少，差异无统计学意义〔(4.3±0.3)% vs (4.1±0.2)%，P>0.05〕。心肌再灌注后两组心肌凋亡细胞均较缺血前显著增加，且远隔缺血时处理组心肌凋亡较对照组减轻明显(P<0.05)。结论远隔缺血时处理可以调控体外循环心脏瓣膜置换术患者心肌MicroRNAs的表达，使miRNA-1和miRNAs-195表达下调，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达和减少促凋亡蛋白BAX表达，心肌细胞凋亡减少。

〔关键词〕远隔缺血时处理；微小RNA；心肌细胞凋亡；心脏瓣膜置换术

心脏外科小样本量临床研究证实，远隔缺血时处理在 心脏和肾脏等器官保护中发挥作用，其能够减少心脏瓣膜置换手术中心肌肌钙蛋白(CTn)I释放，以此来保护心肌〔1〕。但有报道指出，其对心肌等器官的保护效果不明显〔2，3〕。因此，关于远隔缺血时处理在心脏手术中的作用目前没有完全统一的说法，且关于远隔缺血时处理的较大样本量的临床研究尚缺乏。微小RNA(miRNAs )在缺血处理的组织及器官中的保护作用机制越来越受到重视〔4，5〕。 miRNAs是一类在进化上高度保守的小分子非编码RNA，长度为19～25个核苷酸，可发挥转录后调控蛋白质编码基因表达的作用。研究证实，当发生心肌缺血性损伤时，miRNAs被不同程度地表达，参与心肌缺血再灌注过程并发挥重要的调控相应基因的作用〔6，7〕。本文进一步明确远隔缺血时处理对心肌miRNAs表达及心肌细胞凋亡的影响。

1资料与方法

1.1一般资料2013年1月至2015年1月在我院心胸外科择期行体外循环下心脏瓣膜置换手术的风湿性心脏瓣膜病患者60例按照随机数字表法分为远隔缺血时处理组和对照组，每组30例。其中远隔缺血时处理组男12例，女18例，年龄42～65岁，平均(52.1±10.5)岁；对照组男14例，女16例，年龄40～63岁，平均(53.9±8.4)岁。两组年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。均经冠脉造影排除冠心病，且术前常规行胸片，心电图和超声心动图检查，肝肾功能电解质等测定。均知情同意，签署同意书，并经伦理委员会通过。纳入标准：①术前诊断均符合风湿性心脏瓣膜病的诊断标准；②行人工机械瓣膜置换或生物瓣膜者。 排除标准：合并冠心病或高血压、合并感染性心内膜炎者；先天性心脏瓣膜疾病；合并周围血管病；不愿意配合者。

1.2方法所有患者术前准备，全身麻醉后气管插管，右颈内静脉及桡动脉分别置管，连续监测体温、心率、动脉血压、中心静脉压等。全部手术均由同一外科医生操作完成。术中肝素5 mg/kg，心脏停搏期间维持中度低温(肛温在28～31 ℃)，灌注流量约为25 L·min-1·体表面积-1。根据血气调整pH为7.35，动脉血CO2浓度(PaCO2)为35 mmHg左右，动脉血氧浓度(PaO2)维持不低于200 mmHg。阻断升主动脉后，以220～250 ml/min的流速从主动脉根部灌注，对于有明显主动脉瓣关闭不全的患者，可直接切开升主动脉，给予冠状动脉开口直接灌注。后进行正中胸骨切口，升主动脉远端插动脉灌注管，建立常规的体外循环。视具体情况给予连续或间断缝合。心内操作完毕后，开放主动脉阻断钳，主动脉根部吸引排气。检测血流动力学相关指标，一旦正常稳定，即可停机。常规关胸。其中远隔缺血时处理组在阻断主动脉后立即实施下肢缺血/再灌注处理。术中利用10 cm宽的止血带包缚于患者右侧下肢近心端，袖带充气并加压至600 mmHg左右维持5 min，之后完全放气维持5 min，重复3次。对照组放置止血带但不进行充气。术后均给予常规监护 。

1.3标本的采集分别在体外循环开始前及主动脉阻断钳开放后5 min内剪取右心耳组织作为检测标本。 标本采集后立刻用冰生理盐水进行快速漂洗，纱布去血后，直接存入液氮中保存备用。

1.4指标检测①实时定量聚合酶链反应(PCR)(RT-PCR)检测和验证miR-1，miR-21，miR-24和miR-195的表达情况：其中双向引物序列：Bcl-2为正义：3′GACCTGTAGAGCCGCTTCA5′，反义：3′CCACTTGACCCCCTCCTAA5′；BAX：正义：3′TGAGCCTTTTTCTGGAGAGCC5′，反义：3′GTTTGACCACGAGTTCCGAC5′；PDCD4 ：正义：3′AAGAGTTTACGGGAAAGTAGG′，反义：3′TCATAGGAATCGTAACCTCCCC′；Caspase3为正义：3′CAGAGTTACGGTGTCAGGTCAAG5′，反义：3′CCAAGTAGGTGAGCCGAAACAC5′；GAPDH：正义：3′TAGTGCGGTGTCAAAGGG5′，反义：3′AGTTGTCGCTGTGGGTGAG5′。②TUNEL法检测心肌组织心肌细胞凋亡情况：采用TUNEL法对冰冻心肌组织标本进行凋亡细胞检测，主要实验试剂配制及实验操作按照试剂盒进行，主要步骤为组织切片处理→DNA缺口末端标记→组织化学测定→对比染色→封片和显微镜检。镜检TUNEL染色阳性细胞中有棕黄色颗粒者，即凋亡细胞 。显微镜下每张切片随机选择5个400倍视野，计算心肌细胞总数和阳性心肌细胞数，计算凋亡指数，其中凋亡指数=发生凋亡的细胞核数/细胞核总数×100%。

1.5统计学方法采用SPSS20.0统计软件进行t检验，秩和检验。

2结果

2.1心肌miRNA表达实时荧光定量PCR验证远隔缺血时处理组中miR-1和miR-195的表达较对照组降低明显(P<0.05)，miR-24和miR-21的表达情况与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2凋亡相关基因的检测结果比较在翻译水平，远隔缺血时处理组Bcl-2 mRNA表达比对照组显著上调(P<0.05 )，而BAX，PDCD4的mRNA的表达则无明显改变。见表2。

表1　各组miRNA实时定量PCR测定结果比较

与对照组比较：1)P<0.05；下表同

表2　两组心肌Bcl-2 mRNA、BAX mRNA、

2.3心肌组织凋亡情况的TUNEL检测结果比较心肌缺血前远隔缺血时处理组和对照组心肌凋亡细胞数目较少，且两组差异无统计学意义〔(4.3±0.3)% vs (4.1±0.2)%，P>0.05〕。心肌再灌注后两组心肌凋亡细胞均较缺血前显著增加，且远隔缺血时处理组心肌凋亡较对照组减轻明显〔(8.1±2.0)% vs (16.9±2.6)%，P<0.05〕。

3讨论

术后多器官的损伤一直是影响心脏外科患者术后效果及远期生存预后的重要因素。如何减轻体外循环心内直视手术对器官的损伤一直是该领域较为热门的研究话题。心脏瓣膜疾病是后天性心脏病发病中较为常见的一种，其中风湿性心脏病作为导致心脏瓣膜病变的主要病因，能引起患者心肺肝肾等器官功能不同程度受损〔8～11〕。远隔肢体缺血时处理能够减缓心脏瓣膜置换手术心肌cTnI的释放〔12〕。 miRNA的主要作用是与mRNA 3′端非翻译区完全或不完全性互补结合，利用对靶mRNA的抑制或降解，降低相应蛋白表达水平〔13～15〕。 miRNA参与细胞凋亡、分化、能量代谢等多种细胞生理与病理过程，并与人类常见疾病如心肌梗死、心肌重构、心力衰竭、心律失常、心肌肥厚等都有一定的联系〔16，17〕。部分miRNA还能够参与心肌缺血再灌注损伤的发生和保护过程。miRNAs还可能参与体外循环心脏手术术后机体的全身炎症反应等过程，通过调控某些蛋白质翻译和表达，来影响机体多个重要信号传导通路〔18～20〕。细胞凋亡途径包括外源性途径和内源性途径。Bcl-1，Bax，caspase9、Caspase3等为miRNA调节内源性途径介导的细胞凋亡的主要相关蛋白〔21，22〕。通过测定miR-133a、miR-133b、miR-208a的表达能够了解术后早期的心肌损害及恢复情况〔23〕。本研究提示远隔缺血时处理干预可以下调缺血再灌注心肌组织的miR-1和miR-195的表达。miR-1是高度表达于横纹肌及成人心脏中的一种蛋白，miR-1在缺血再灌注损伤时表达有所增加，相对于健康成人，急性心肌梗死者的血浆miR-1水平升高显著〔24〕；miR-195不仅可以调控细胞周期，并能够加速细胞凋亡的进程〔25〕，有研究显示，miR-195通过降低心肌细胞sirt1基因的表达来加速细胞的凋亡〔26〕。可见miR-1及miR-195在心肌损伤级细胞凋亡中扮演重要作用。本研究提示远隔缺血时处理可能通过miR-1和miR-195的下调途径使心肌细胞凋亡减轻。但确切的机制需要更加深入的研究。

Bcl-2基因是目前研究的最深入、最广泛的凋亡调控基因之一。其表达和调控是影响细胞凋亡的关键，参与细胞凋亡的信号转导途径 。 Bcl-2利用自身的BH3结构域与Bcl-2家族的促凋亡蛋白结合，进而来维持促凋亡成员在细胞内的定位分布，屏蔽细胞不进入凋亡程序，以此来发挥抗凋亡功效〔27〕。 Bax作为Bcl-2基因家族的一个亚型，是极重要的促细胞凋亡基因的一种，与Bcl-2发挥着相反的作用，能够加速细胞的凋亡；下调miR-1可以减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡，其机制可能是利用调控抗凋亡基因Bcl-2转录后的表达来发挥其自身的作用。PDCD4是最早在动物体内发现的一种与细胞凋亡相关的基因，能够利用自身功能区与真核细胞的翻译起始因子eIF4A结合，阻止核糖体复合物及蛋白质的合成，加速细胞凋亡〔28〕。有学者指出，miR-21是通过作用于其靶基因PDCD4来发挥抗凋亡作用，进而发挥对抗缺血再灌注损伤的作用〔29〕。

综上，远隔缺血时处理可以调控体外循环心脏瓣膜置换术患者心肌MicroRNAs的表达，使miRNA-1和miRNAs-195表达下调，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达和减少促凋亡蛋白BAX表达，心肌细胞凋亡减少。 推测远隔缺血时处理的心肌保护作用可能通过调控心肌miRNAs及其相应的靶基因和蛋白质表达而发挥作用。

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〔2015-02-19修回〕

(编辑苑云杰)

基金项目：海南省应用技术研发与示范推广专项项目(No.ZDXM2015074)

〔中图分类号〕R654.2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)09-2105-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.024

第一作者：邢杰(1965-)，男，副主任医师，主要从事心脏病研究。