胃损伤修复中骨髓干细胞的作用

孔　渊　牛　惠　刘　馨

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁　锦州　121000)



胃损伤修复中骨髓干细胞的作用

孔渊牛惠刘馨

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121000)

〔摘要〕目的探讨骨髓干细胞在急性胃损伤修复过程中的定植及作用。方法在绿色荧光蛋白鼠骨髓移植模型基础上，通过化学诱导造成小鼠胃部急性损伤，刺激干细胞参与组织自我修复。结果模型15例中有11例绿色荧光蛋白鼠骨髓成功定植在损伤，最终死亡2例(P<0.05)。结论骨髓干细胞在胃损伤修复过程中参与定植和分化并参与组织的自我修复，该方法是预防治疗胃损伤和遗传性胃部疾病的一种理想方法。

〔关键词〕骨髓干细胞；消化道病变；损伤；自我修复

近年来国内外已有许多关于骨髓移植治疗血液病、肝硬化、心肌梗死等疾病的临床研究〔1～4〕，骨髓干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的能力，而但在消化道疾病治疗中暂属空缺。本实验旨在探究骨髓干细胞在胃损伤修复中的定植与作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物C57BL/6小鼠购自辽宁医学院动物实验管理中心，SPF级条件饲养；绿色荧光蛋白(GFP)小鼠购自辽宁医学院动物实验管理中心，清洁级条件饲养。

1.1.2试剂白消安和CD34-PE单抗购自美国Santa Cruz公司，环磷酰胺(TXT)购自江苏恒瑞医药，红霉素和庆大霉素购自利君制药，苏木精-伊红(HE)染液购自珠海贝索生物有限公司，无水乙醇购自天津津东天正精细化学试剂厂。

1.1.3仪器流式细胞仪(BD FACSVantage SE，美国BD公司)，台式高速离心机(TGL-10C，上海安亭科学仪器厂)，石蜡包埋机(KD-BMⅢZ，浙江金华科迪有限公司)，石蜡病理切片机(Leica RM2235，德国Leica公司)，荧光倒置显微镜(OLYMPLUS IX51，日本OLYMPLUS公司)。

1.2实验分组选取雌雄各半、约10周龄、体重为(25±5)g的SPF级C57BL/6小鼠50只及清洁级GFP鼠10只，其中随机选取C57BL/6小鼠25只作为对照组，其余25只作为化学诱导组。

1.3骨髓移植动物模型的制备对照组与化学诱导组采取白消安及TXT联合化疗，建立小鼠骨髓移植受体模型。用无菌蒸馏水将白消安稀释为400 mg/ml浓度，按照4 mg/kg的剂量，通过灌胃针给C57小鼠灌胃，1次/d，持续4 d，第5天起用无菌生理盐水将TXT稀释为500 mg/ml浓度，按照50 mg/kg的剂量，通过尾静脉注射C57小鼠，1次/d，持续3 d。用药结束后，以小鼠通过体重测量化疗前后减轻10%及血常规检查各系血细胞明显降低者为骨髓抑制标准，选取其中造模成功的30只小鼠随机均分为对照组和化学诱导组。

1.4骨髓干细胞的获取及CD34阳性细胞计数随机抽取GFP小鼠4只，颈椎脱臼处死后，在75%酒精中浸泡消毒10 min，在超净工作台中使用无菌剪刀分离出股骨和胫骨，剪开两骺端，用1 ml注射器吸取DMEM培养基，反复冲洗骨髓腔至髓腔发白。用1 ml移液器反复吹打冲出的培养基，形成骨髓单细胞悬液，通过血细胞计数板计数，取1×106个细胞加入30 μl小鼠血清封闭非特异性结合位点，加入10 μl PE标记的大鼠抗小鼠CD34抗体，对照管加入相应的阴性抗体，4℃避光反应30 min，加入2 ml红细胞裂解液，作用5 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞2次，上机检测。

1.5骨髓干细胞移植通过CD34阳性细胞计数结果，将骨髓单细胞悬液重新调整浓度为3×107/ml，化疗结束后12 h通过尾静脉注射骨髓单细胞悬液，注射体积为0.3 ml，共计1×107个细胞，移植72 h后，再次注射入相同数量的细胞。骨髓移植前后均隔离饲养，添加250 mg/L红霉素和320 mg/L庆大霉素的饮水，防止感染。

1.6小鼠胃黏膜损伤模型骨髓移植2 w后，对照组小鼠在0、2、4、6 d采取空腹灌胃蒸馏水0.3 ml，1次/d；化学诱导组在0、2、4、6 d采取空腹灌胃75%无水乙醇0.3 ml，1次/d。造成小鼠胃黏膜损伤模型。

1.7受体小鼠骨髓GFP阳性细胞鉴定酒精灌胃后，正常饮食饲养7 d后颈椎脱臼处死小鼠，分离股骨和胫骨，将骨髓干细胞制成单个细胞悬液，取1×106个细胞用PBS冲洗2次，同法获取正常的C57BL/6及GFP小鼠骨髓的单个细胞悬液，作为阴性对照管及阳性对照管，上流式细胞仪检测。

1.8消化道组织病理学检查将脱臼处死的小鼠解剖取胃，沿胃大弯侧剪开，用冷生理盐水漂洗胃内容物，将胃壁展平固定在平台上，在解剖显微镜下观察胃黏膜的损伤情况，经过脱水固定后切片，进行苏木素-伊红(HE)染色。

1.9统计学方法采用SPSS17.0 软件进行t检验。

2结果

2.1骨髓有核细胞中CD34+细胞比例随机抽取GFP鼠，通过无菌操作获取小鼠骨髓，经过处理获取单细胞悬液，采用CD34-PE抗体特异性标记，与CD34-PE阴性对照管用流式细胞仪上机测定，获取GFP鼠骨髓中的CD34阳性细胞数，通过CD34阳性细胞数确定骨髓移植骨髓干细胞数目(1.08%)。

2.2GFP阳性细胞在受体小鼠骨髓中定植正常GFP鼠骨髓干细胞中GFP阳性细胞占比为97.26%，经骨髓移植后定植在C57BL/6骨髓移植受鼠的GFP鼠骨髓中GFP阳性细胞数占88.35%，较GFP阴性对照管GFP阳性细胞数(0.86%)有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.3GFP骨髓干细胞在受损消化道定植化学诱导结束1 w后解剖对照组和化学诱导组小鼠，荧光倒置显微镜镜下观察病理组织切片，对照组小鼠HE染色下，胃黏膜无病理变化，仅黏膜下小血管中有GFP表达；化学诱导组中小鼠胃黏膜层中有大量炎症细胞浸润，胃黏膜上皮细胞中有GFP表达，化学诱导小鼠15例，其中11例胃黏膜层有GFP表达，死亡2例，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

A：对照组；B：对照组荧光显微镜下仅血管中有GFP阳性细胞；C：化学诱导组，黏膜层可见大量炎性细胞浸润；D：化学诱导组荧光显微镜下可见大量GFP阳性细胞图1　胃病理切片(HE)

3讨论

骨髓干细胞具有多向分化潜能、造血支持、促进干细胞植入和自我修复等特点，骨髓干细胞因处于未定向分化和强增殖能力状态下，在合适的条件或信号下可分化增殖成不同类型、不同功能、不同形态的组织干细胞〔5〕，进一步参与组织自我修复等为骨髓治疗提供可能，受到国内外的学者关注，已有通过骨髓移植治疗血液病、肝硬化、心肌梗死、扩张型心肌病、心功能衰竭、糖尿病等疾病的临床研究〔6～9〕。在骨髓移植治疗中，CD34细胞作为筛选、计数骨髓干细胞的标志物已广泛应用于临床，CD34细胞可以参与骨髓干细胞的运输、定植等〔10，11〕。

消化道疾病是由多因素参与的多发常见病，总发病率占人口的20%左右，消化道肿瘤占癌症发病率的43.3%，其中胃癌占消化道肿瘤发病率一半，胃疾病如不及时治疗，进展速度快，极易转化为癌症，慢性萎缩性胃炎、胃溃疡、胃息肉、残胃炎等都可转变成胃癌。

本研究发现，消化道黏膜更新速度快，平均7 d更新一次，为骨髓移植治疗消化道疾病提供可能，本研究发现骨髓干细胞移植参与胃损伤疾病修复，当胃黏膜受到刺激发生损伤时，骨髓干细胞可定向转化为胃干细胞，定植于受损部位，定向分化为主细胞和壁细胞等胃黏膜组织，参与组织的自我修复，形成新的胃黏膜组织，说明骨髓干细胞移植对胃损伤有临床治疗意义，但具体机制有待进一步研究。

4参考文献

1Saito T，Tomita K，Hagh H，etal.Bone marrow cell-based regenerative therapy for liver cirrhosis〔J〕.World J Methodol，2013；3(4)：65-9.

2Tomita S，Lir K，Weiselr D，etal.Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function〔J〕.Circulation，1999;100(Supplement 2)：Ⅱ-247-Ⅱ-56.

3Luthe S，Juns J，Wessenm K，etal.Bone marrow side population cells are enriched for progenitors capable of myogenic differentiation〔J〕.J Cell Sci，2008;121(Pt 9)：1426-34.

4刘媛，刘毓刚，吴丽娟，等.流式细胞术干祖细胞分类计数在自体造血干细胞移植治疗恶性血液系统疾病中的应用〔J〕.国际检验医学杂志，2011;32(20)：2310-2.

5施昱晟，顾鸣敏.诱导多能干细胞的研究现状及应用前景〔J〕.诊断学理论与实践，2012;11(3)：312-6.

6何琼，朱陇东，陈红.骨髓间充质干细胞移植在大鼠急性肝损伤组织中的定植能力〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2009;13(23)：4437-42.

7李彦林，韩睿，王福科.骨髓间充质干细胞在骨及软骨组织工程中的应用〔J〕.中国临床康复，2006;10(5)：124-5.

8吕铁伟，田杰，朱静，等.骨髓间充质干细胞体内诱导分化为心肌细胞的初步实验观察〔J〕.重庆医科大学学报，2003;28(4)：463-7.

9田文，曾定尹，Michael K，等.骨髓动员对骨髓造血干细胞在心肌梗死后心脏中定植及分化的影响〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志，2009;3(7)：304-10.

10刘艳荣，陈珊珊，于弘.流式细胞术计数CD34阳性细胞的标准化与质量控制〔J〕.中国实验血液学杂志，2000;8(4)：302-5.

11程昊钰，何明生，王延华，等.绿色荧光蛋白转基因小鼠CD34_脊髓全横断大鼠模型中的存活及迁移〔J〕.中国病理生理杂志，2007;23(3)：579-83.

〔2015-12-21修回〕

(编辑滕欣航)

基金项目：辽宁省科技厅科技计划项目(2014410004)；辽宁医学院校长基金项目

通讯作者：刘馨(1977-)，男，副教授，副主任检验师，硕士生导师，主要从事临床肿瘤标记物研究。

〔中图分类号〕R39

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)09-2067-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.008

第一作者：孔渊(1988-)，男，在读硕士，主要从事临床肿瘤标记物研究。