MT01对人成骨样细胞系MG63内Toll样受体7,9表达的影响

孙　晗　侯　旭　申玉芹　郑　义　娄译心　汪　洋　齐　佳　孙新华

(吉林大学口腔医学院，吉林　长春　130021)



MT01对人成骨样细胞系MG63内Toll样受体7,9表达的影响

孙晗侯旭申玉芹郑义娄译心汪洋齐佳孙新华

(吉林大学口腔医学院，吉林长春130021)

〔摘要〕目的探讨人成骨样细胞系MG63(简称MG63)内Toll样受体(TLRs)的表达情况及MT01与细胞内TLRs的关联。方法应用RT-PCR法检测MG63内TLR1～10 mRNA的表达情况；MT01与MG63作用12、24、48 h后,Real time PCR法检测MG63细胞内TLR7,9 mRNA表达的变化；Western印迹法检测MG63细胞内TLR7,9 蛋白表达的变化。结果MG63细胞表达TLR1～10 mRNA；一定浓度的MT01作用于细胞后,对TLR7,9 mRNA及蛋白表达有显著的抑制作用，这种抑制作用无时间依赖性。结论MG63细胞表达TLR1-10 mRNA，一定浓度的MT01可影响MG63细胞内TLR7,9 mRNA及蛋白的表达。

〔关键词〕MT01；人成骨样细胞系MG63；Toll样受体

Toll样受体(TLRs)是一种模式识别受体，在高等脊椎动物的固有免疫和适应性免疫中起着枢纽作用〔1〕。有研究表明，TLRs家族中诸如TLR9对牙槽骨改建具有调控作用，可调控骨改建过程中成骨细胞的成骨分化〔2〕。目前发现，在TLRs受体家族中，存在于内质网和溶酶体上的TLR7,9可识别引发早期固有免疫应答的核酸类分子如寡脱氧核糖核苷酸(ODN)等〔3～5〕。MT01是本课题组依据人线粒体DNA序列设计并人工合成的单链DNA，是一种免疫负性调节剂，可抑制免疫细胞如人外周血单核细胞内TLR7,9与激动剂结合产生的炎症反应〔5〕。笔者前期研究发现MT01可促进成骨细胞增殖、活化,抑制实验性大鼠牙周炎导致的牙槽骨吸收,促进骨形成〔6,7〕。本实验拟研究一定浓度MT01对成骨细胞MG63内TLR7,9表达的影响，为进一步阐述MT01调控骨改建的免疫学机制奠定基础。

1材料与方法

1.1实验材料与试剂超净工作台(TECH，中国)；恒温离心机(beckman coulter,美国)； CO2恒温细胞培养箱(SANYO，日本)；倒置相差显微镜(OLYMPUS，日本)；100 mm培养皿、 6孔板、8联管(COSTAR，美国)；人源性成骨样细胞系 MG63 (ATCC,CRL-1427)，MT01(吉林大学基础医学院分子生物学教研室自主设计、大连TAKARA全硫代修饰合成)；HG-DMEM(Gibco，美国)；胎牛血清(PAA 公司，美国)；胰蛋白酶(Sigma 公司，美国)； TLR7,9一抗(博奥森，中国)；β-actin一抗(Abcam,美国)；过氧化物酶标记的第二抗体(Molecular Probes，美国)；RIPA裂解液 (鼎国昌盛，中国)； TLR7,9 mRNA引物合成(三博远志，中国)；SYBR Premix Ex Taq(大连TAKARA,中国)；Primer Script RT reagent Kit(大连TAKARA,中国)；反转录(RT)-PCR引物序列：TLR1：正义：CAGTGTCTGGTACACGCATGGT，反义：TTTCAAAAACCGTGTCTGTTAAGAGA；TLR2：正义：GCCAAAGTCTTGATTGATTGG，反义：TTGAAGTTCTCCAGCTCCTG；TLR3：正义：CCTGGTTTGTTAATTGGATTAACGA，反义：TGAGGTGGAGTGTTGCAAAGG；TLR4：正义：GGTGGAAGTTGAACGAATGG，反义：CTGTCCTCCCACTCCAGGTA；TLR5：正义：CAGAAACCTGCCCAACCTTAG，反义：GATCCAAGCGAGTTAAAGCCTT；TLR6：正义：GTGAGTGGTGCCATTACGAA，反义：TTTGGGAAAGCAGAGTGGAG；TLR7：正义：TTACCTGGATGGAAACCAGCTAC，反义：TCAAGGCTGAGAAGCTGTAAGCTAG；TLR8：正义：AGCGGATCTGTAAGAGCTCCATC，反义：CCGTGAATCATTTTCAGTCAAGAC；TLR9：正义：GCAGTCAATGGCTCCCAGTTC，反义：GCGGTAGCTCCGTGAATGAGTG；TLR10：正义：TTATGACAGCAGAGGGTGATGC，反义：CTGGAGTTGAAAAAGGAGGTTATAGG；GAPDH：正义：CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，反义：TGAGCGATGTGGCTCGGCT。实时荧光定量(Real time)PCR引物序列:TLR7:正义：GGAGGTATTCCCACGAACACC，正义：TGACCCCAGTGGAATAGGTACAC；TLR9：正义：GGACCTCTGGTACTGCTTCCA，正义：AAGCTCGTTGTACACCCAGTCT；GAPDH：反义CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，反义：TGAGCGATGTGGCTCGGCT。

1.2实验方法

1.2.1RT-PCR法检测MG63内TLRs mRNA的表达情况 复苏 MG63，含10%胎牛血清的HG-DMEM 完全培养液培养、传代，3×105个/孔细胞浓度铺6孔板，孵育24 h，收集细胞，Trizol法提取总RNA，TAKARA逆转录试剂盒逆转录合成cDNA。配制25 μl RT PCR反应体系：Buffer(10×)2.5 μl,10 mmol/L dNTPs 2 μl,cDNA 1 μl,PCR上游引物0.5 μl,PCR下游引物0.5 μl,TaqDNA 聚合酶1 μl (2U),dd H2O 17.5 μl。PCR 条件为 94℃,60 s;55℃,120 s;72℃,90 s;循环30次。PCR 产物琼脂糖凝胶电泳后,在GIS 1D 凝胶成像分析系统上扫描定量。

1.2.2Real time PCR法检测MT01作用后不同时间点MG63内TLR7,9 mRNA的表达情况细胞培养、铺板同前，加入含有1 mg/L MT01的完全培养基后，于共孵育12、24、48 h分别收集细胞，加入同体积磷酸盐缓冲液(PBS)设为空白对照组。RNA 提取及逆转录同前。在8连管中配制25 μl Real time PCR 反应体系：SYBR Primer Ex TaqTM(2×)12.5 μl，PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl,ROX reference DyeⅡ(50×) 0.5 μl，cDNA 2 μl,ddH2O 9 μl。反应条件：95℃,10 min;95℃,15 s;60℃,1 min，循环48次。

1.2.3Western印迹法检测MT01作用后不同时间点MG63内TLR7,9 蛋白的表达情况细胞培养、铺板同前，加入含有1 mg/L MT01的完全培养基后，于共孵育12、24、48 h分别收集细胞，加入同体积PBS设为空白对照组。按照试剂盒说明提取蛋白质并对其进行定量。之后分别将预染蛋白和样品液上样，电泳分离总蛋白。按Bio-Rad蛋白转移说明书组装滤纸凝胶纤维素夹层,60 V恒压条件下,4℃转移2 h。将转移后的膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育2 h,以封闭膜上的非特异性结合位点。封闭后的膜加入一抗，4℃孵育过夜。加入过氧化物酶标记的二抗以结合一抗,室温孵育2 h。化学发光法检测,膜与化学发光底物孵育,经X胶片曝光显影。

1.3统计学方法采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1MG63内TLRs mRNA表达情况成骨样细胞MG63内有TLR1～10 mRNA的表达，其中TLR2,5,10 mRNA表达稍弱 (图1)。

图1　RT-PCR法检测MG63内TLR1～10 mRNA的表达情况

2.2不同时间点MT01对TLR7,9 蛋白表达的影响12、24 h组，TLR7蛋白量与对照组相比显著减少，而48 h组的TLR7蛋白量与12、24 h组相比稍有增高，但仍低于对照组。实验组TLR9蛋白的表达量低于对照组(图2)。

图2　MT01作用于MG63后，不同时间点TLR7, TLR9蛋白的表达情况

2.3不同时间点MT01对TLR7,9 mRNA表达的影响Real time PCR检测显示：MT01能抑制细胞内TLR7,9 mRNA的表达。12、24 h组中的TLR7 mRNA的表达量(0.072、0.071)显著减少，与对照组(设为1)比差异显著(P<0.05)；48 h组中的TLR7 mRNA的表达量(0.124)与前两组相比略微增高，但仍低于对照组(P<0.05)。12、24、48 h组中的TLR9 mRNA表达量(0.443、0.146、0.149)均低于对照组(设为1)(P<0.05)。但MT01对TLR7,9 mRNA的抑制作用没有明显的时间依赖性。

3讨论

人成骨样细胞系MG63具有与人成骨细胞相似的表型特征及分化特性〔8〕，因其具有易培养、价格便宜、取材方便等特性，近年来被广泛用来研究成骨等方面的特性。关于不同来源的成骨细胞上TLRs的表达情况目前尚无定论。Yasuyuki等〔9〕研究发现人成骨细胞系SaOS-2表达TLR1,4,5,6,9 mRNA；有学者研究发现骨髓间充质干细胞上表达TLR1～10 mRNA〔10〕；而Takeshi等〔11〕对于MC3T3的研究发现老鼠的成骨细胞仅表达TLR2,4,3,6 mRNA。造成这种差异的原因可能由于细胞起源及细胞种类不同，所能表达的TLRs种类也各不相同〔12〕。本实验结果说明TLRs的表达可能受细胞种类的影响。这也提示如果选用不同种属的细胞进行实验，还要注意种属特异性的问题。

MT01(5'-ACCCCCTCTACCCCCTCTACCCCCTCT-3')的序列富含胞嘧啶，Yang等〔5〕研究表明MT01可以识别免疫细胞内的TLRs，并且抑制由TLR7,9介导的炎症反应，这种免疫负调节活性可能是序列依赖性的。通过Hou等〔13〕对MT01进入细胞的时相性观察发现，随着加药时间的变化， MT01 进入细胞的量表现出一定的时间依从性规律，在12 h进入细胞的量达到了峰值。本实验结果说明MT01能抑制TLR7蛋白的表达。同时间点检测的蛋白量与基因量稍有差异可能是由于在转录后的翻译过程中，影响翻译的条件如原料、模板、能量和酶等发生变化引起的〔14〕。

有研究表明TLR7,9的激活可导致自身免疫性疾病〔15〕、类风湿关节炎〔16〕及各种自身免疫性疾病的发生。同时有研究表明表达于成骨细胞及破骨细胞上TLR9的激活，可以诱导产生各种炎性因子如白介素、肿瘤坏死因子等〔2〕。这些炎性因子协同作用可以抑制成骨细胞的成骨功能，促进破骨细胞活化，从而破坏骨改建的平衡，导致骨吸收〔17〕。本实验所用的这种新型的寡核苷酸MT01可以抑制TLR7,9的表达，抑制早期祖细胞的TLRs活化，抑制骨含量减少，保持骨代谢与免疫系统的平衡。本实验发现MT01作为一种免疫负性调节剂能够影响成骨细胞TLR7,9的表达，进而可以影响骨改建进程，因此，MT01有可能成为潜在的骨吸收抑制剂。深入研究MT01与骨改建的关系，可为今后的临床应用提供一定实验基础。

4参考文献

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3Tengroth L,Millrud CR,Kvarnhammar AM,etal.Functional effects of Toll-like receptor (TLR)3,7,9,RIG-I and MDA-5 stimulation in nasal epithelial cells〔J〕.PLoS One,2014;9(6):e98239.

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5Yang G,Wan M,Zhang Y,etal.Inhibition of a C-rich oligodeoxynucleotide on activation of immune cells in vitro and enhancement of antibody response in mice〔J〕.Immunology,2010;131(4): 501-12.

6Feng ZY,Shen YQ,Wang LY,etal.An oligodeoxynucleotide with promising modulation activity for the proliferation and activation of osteoblast〔J〕.Int J Mol Sci,2011;12(4):2543-55.

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10He XX,Bai H,Yang GR,etal.Expression of Toll-like receptors in human bone marrow mesenchymal stem cells〔J〕.J Exp Hematol,2009;17(3):695-9.

11Takeshi K,Tetsuya M.Gene expression of osteoclast differentiation factor is induced by lipopolysaccharide in mouse osteoblasts via Toll-like receptors〔J〕.Immunol,2001;166(5):3574-9.

12Ian M.Osteoblast responses to bacterial pathogens〔J〕.Immunol Res,2004;30(3):291-308.

13Hou X,Shen YQ,Zhang CH,etal.A specific oligodeoxynucleotide promotes the differentiation of osteoblasts via ERK and p38 MAPK pathways〔J〕.Int J Mol Sci,2012;13(7):7902-14.

14Chen DD,Ma FX,Xu SX,etal.Expression and role of Toll-like receptors on human umbilical cord mesenchymal stromal cells〔J〕.Cytotherapy,2013;15(4):423-33.

15Lenert P.Inhibitory oligodeoxynucleotides-therapeutic promise for systemic autoimmune diseases〔J〕.Clin Exp Immunol,2005;140(1):1-10.

16Marshak-Rothstein A.Toll-like receptors in systemic autoimmune disease〔J〕.Nat Rev Immunol,2006;6(11):823-35.

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〔2016-03-16修回〕

(编辑曲莉)

基金项目：吉林省科技厅自然科学基金面上项目资助项目(20150101173JC);吉林大学白求恩医学科研支持计划(2012080632)

通讯作者：孙新华(1954-)，女，教授，主要从事牙齿移动生物学研究。

〔中图分类号〕R783.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)09-2071-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.010

第一作者：孙晗(1990-),女，在读硕士，主要从事牙齿移动生物学研究。