微小RNA(miR)-155对脂多糖所致小鼠急性肺损伤的干预作用

马　丞　阿赛古丽

(西北民族大学医学院，甘肃　兰州　730030)



微小RNA(miR)-155对脂多糖所致小鼠急性肺损伤的干预作用

马丞阿赛古丽

(西北民族大学医学院，甘肃兰州730030)

〔摘要〕目的探讨微小RNA(miR)对脂多糖(LPS)所致小鼠急性肺损伤的干预作用。方法35只SPF级雄性C57小鼠随机分为LPS致伤组、miR-155抑制组、miR对照组、miR-155增强组、空白对照组，每组7只。空白对照组不做任何处理；另外四组小鼠建立LPS急性肺损伤模型，LPS致伤后45 min，LPS致伤组行气管穿刺注入生理盐水，miR-155抑制组、miR对照组、miR-155增强组分别注入0.02 nmol/μl相应试剂5 μl。24 h后取完整肺组织，苏木素-伊红(HE)染色观察组中形态，实时定量PCR检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β mRNA表达情况，Taqman探针法检测miR-155表达情况，Western印迹法检测环氧化酶(COX)-2蛋白表达情况。结果LPS致伤组、miR-155抑制组、miR对照组、miR-155增强组中TNF-α、IL-1β mRNA表达水平明显高于空白对照组(P<0.05)，miR-155增强组明显低于LPS致伤组、miR-155抑制组、miR对照组(P<0.05)。miR-155增强组miR-155表达水平明显高于LPS致伤组、miR-155抑制组、miR对照组(P<0.05)。空白对照组COX-2蛋白表达量明显低于另外四组(P<0.05)。结论miR-155可明显减弱LPS所致的小鼠急性肺损伤炎症反应。

〔关键词〕急性肺损伤；微小RNA；脂多糖

目前急性肺损伤多集中于发病机制和药物机制方面，尚缺乏主动特异性治疗方法，而特异性治疗对于机体功能偏低的老年急性肺损伤患者具有更重要的意义。相关研究显示，通过抑制炎性反应和放大效应来控制病情进展具有较好的可行性〔1〕。微小RNA(miR)是近年来国内外基因调控领域的研究焦点，已证实其参与到炎症的发生、发展过程〔2〕。本次研究建立脂多糖(LPS)小鼠急性肺损伤模型，气管给药后检测肺组织中炎性介质表达情况，拟探讨miR-155对急性肺损伤的干预作用。

1材料与方法

1.1动物及材料健康SPF级雄性C57小鼠35只，体重(22±2)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。Trizol试剂(南京安培化工科技有限公司)；miR-155增强剂、抑制剂、对照剂(北京泰泽瑞达科技有限公司)；肿瘤坏死因子(TNF)-α引物、白细胞介素(IL)-1β引物(南京森贝伽生物科技有限公司)；miR-155反义探针、U6反义探针、LPS(Sigma公司)；Taq-man miR实时荧光定量试剂盒、miR逆转录试剂盒(深圳盎然生物科技有限公司)；美国ABI 7500型实时荧光定量仪，德国Eppendorf高速低温离心机。

1.2方法

1.2.1分组及建立模型将35只C57小鼠随机分为LPS致伤组、miR-155抑制组、miR对照组、miR-155增强组、空白对照组，每组7只。空白对照组不做任何处理；另外四组小鼠按5 mg/kg剂量腹腔注射1%的戊巴比妥钠，麻醉后切开小鼠颈部皮肤和组织暴露气管，行气管穿刺按4 mg/kg剂量向肺中注入20 μg/μl的LPS建立急性肺损伤模型。LPS致伤后45 min，LPS致伤组行气管穿刺注入生理盐水，miR-155抑制组、miR对照组、miR-155增强组分别注入0.02 nmol/μl相应试剂5 μl，颈部皮肤缝合。五组小鼠继续喂养24 h后麻醉，取完整肺组织后断髓处死。

1.2.2标本采集和处理将小鼠左肺上叶在10%的甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察肺组织损伤程度。剩余的肺组织剪成边长为1 mm的正方体小块，锡纸包裹后-80℃保存，用于提取组织蛋白和RNA。

1.2.3TNF-α、IL-1β mRNA、miR-155表达取小块肺组织，匀浆后Trizol法提取总RNA。采用绿色荧光染料法实时定量PCR扩增，检测TNF-α、IL-1β mRNA表达情况。cDNA合成条件：37℃、20 min，98℃、10 min，4℃保存；反应体系10 μl，其中包括2 μl逆转录缓冲液、1 μl逆转录酶、1 μl P混合液、6 μl RNA，5倍稀释备用。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。常规反应条件下40个循环扩增后绘制溶解曲线，定量分析。采用Taqman探针法实时定量PCR检测miR-155表达情况。cDNA合成条件：16℃、40 min，42℃、5 min，85℃、5 min，4℃保存；反应体系15 μl，100 mmol三磷酸碱基脱氧核苷酸0.2 μl，1 μl逆转录酶、2 μl 缓冲液、6 μl RNA，5倍稀释备用。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。反应条件：95℃预变性5 min，95℃ 20 s，60℃ 40 s，40个循环。扩增后记录各组Ct值，定量分析。

1.2.4环氧化酶(COX)-2蛋白表达采用Western印迹法检测：取小块肺组织，加RIPA蛋白裂解液，提取组织蛋白，蛋白裂解液稀释至25 mg/ml。按3∶1体积加缓冲液，水浴20 min，聚丙烯酰胺(PAGE)胶电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉Tris-HCl缓冲液(TBST)封闭60 min。加兔抗鼠COX-2(1∶2 000)，4℃孵育过夜，Tween20/TBS溶液洗涤3次，15 min/次；加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔单克隆抗体，4℃孵育过夜，Tween20/TBS溶液洗涤3次，加发光液，反应10 min后暗室曝光、显影、定影。β-肌动蛋白为内参，Image-Pro Plus软件测定蛋白表达情况。

1.3统计学方法采用SPSS20.0软件进行t检验、方差分析。

2结果

2.1各组小鼠肺组织病理学变化空白对照组小鼠肺泡结构完整、大小均匀，肺泡腔和肺间质未见明显炎细胞浸润。LPS致伤组、miR-155抑制组、miR对照组均存在毛细血管充血，肺间质水肿，肺泡腔存在明显炎性细胞浸润；miR-155增强组肺泡间充血程度，肺泡壁损伤和炎性细胞浸润程度轻于LPS致伤组、miR-155抑制组、miR对照组。见图1。

2.2各组小鼠TNF-α、IL-1β mRNA、miR-155表达情况LPS致伤组、miR-155抑制组、miR对照组、miR-155增强组中TNF-α、IL-1β mRNA表达水平均明显高于空白对照组(P<0.05)，造模成功。miR-155增强组TNF-α、IL-1β mRNA表达水平明显低于LPS致伤组、miR-155抑制组、miR对照组(P<0.05)。miR-155增强组miR-155表达水平明显高于LPS致伤组、miR-155抑制组、miR对照组(P<0.05)。见表1。

图1　各组小鼠肺组织病理学变化情况(HE，×40)

组别TNF-αIL-1βmRNAmiR-155LPS致伤组25.58±4.531)2)56.85±4.611)2)0.83±0.102)miR-155抑制组39.81±4.321)2)63.82±5.081)2)1.18±0.462)miR对照组37.10±4.971)2)60.18±5.371)2)0.91±0.292)miR-155增强组13.67±3.171)26.44±4.381)165.26±17.95空白对照组1.15±0.521.22±0.551.03±0.37

与空白对照组相比：1)P<0.05；与miR-155增强组相比：2)P<0.05

2.3各组小鼠COX-2蛋白表达水平比较空白对照组COX-2蛋白表达量为(0.74±0.08)；LPS致伤组、miR-155抑制组、miR对照组、miR-155增强组COX-2蛋白表达量分别为(1.05±0.07)、(1.07±0.10)、(1.02±0.04)、(0.88±0.08)。空白对照组COX-2蛋白表达量明显低于另外四组(P<0.05)。见图2。

1～5分别为：LPS致伤组、miR-155抑制组、miR对照组、miR-155增强组、空白对照组图2　Western印迹检测各组小鼠肺组织中COX-2蛋白表达

3讨论

miR可维持生物机体稳定状态，调节生长发育，影响疾病的发生、发展。研究显示，miR-155可参与机体对炎性介质的免疫应答，维持免疫功能的正常〔3〕。相关基础研究认为，miR-155作用于靶基因抑制性KB激酶(IKK)家族相关死亡域蛋白，减弱核转录因子(NF)-κB活性，按照次级效应方式对炎性因子的释放产生抑制效果，降低机体损伤〔4〕。由于大鼠miR给药剂量较大，为控制研究成本，本次研究采用小鼠急性肺损伤模型，与以往该领域多数采用的急性肺损伤实验大鼠模型不同。急性肺损伤病理生理过程中会分泌大量的炎性因子(如TNF-α、IL-1β)〔5〕。COX-2蛋白是发生炎性反应的关键酶，当多种刺激因素作用于细胞时，其表达水平明显上升〔6〕。本文显示，LPS会导致小鼠肺组织分泌大量TNF-α、IL-1β，COX-2蛋白表达也明显上调，在给予小鼠气管注射miR-155增强剂后，TNF-α、IL-1β mRNA和COX-2蛋白表达均降低，但转染miR-155抑制剂之后上述指标表达不明显，可能与miR-155基础量不高有关；HE染色结果说明miR-155能够有效抑制LPS引发的急性肺损伤炎性反应。相关研究显示，miR-155靶向抑制髓样分化因子为NF-κB信号通路的连接蛋白，能够对幽门螺旋杆菌导致的炎性反应起到负调控作用〔7〕。在急性肺损伤模型中，miR-155能否通过抑制髓样分化因子减弱炎性反应，需进一步研究。

4参考文献

1Lai TS，Wang ZH，Cai SX.Mesenchymal stem cell attenuates neutrophil-predominant inflammation and acute lung injury in an in vivo rat model of ventilator-induced lung injury〔J〕.Chin Med J，2015；128(3)：361-7.

2Kuiper JW，Plötz FB，Groeneveld AJ,etal.High tidal volume mechanical ventilation-induced lung injury in rats is greater after acid instillation than after sepsis-induced acute lung injury，but does not increase systemic inflammation：an experimental study〔J〕.BMC Anesthesiol，2013；11(1)：26.

3李波.小鼠急性肺损伤时期促炎症消退介质脂氧素的变化及调节机制研究〔D〕.武汉：华中科技大学，2013.

4李昕辉，滕飞.白细胞介素23基因沉默对支气管哮喘小鼠的影响〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2015；16(1)：38-42.

6韩丙超.汽化吸入全氟化碳对内毒素性急性肺损伤兔表面活性蛋白和基质金属蛋白酶的影响〔D〕.北京：军医进修学院，2012.

7刘振宁.PPAR-γ激动剂对百草枯致大鼠急性肺损伤的保护作用及机制研究〔D〕.沈阳：中国医科大学，2013.

〔2015-08-10修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

基金项目：甘肃省高等学校科研项目(No.2014A-088)

通讯作者：阿赛古丽(1972-)，女，博士，教授，主要从事临床医学实验研究。

〔中图分类号〕R563

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)09--；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.006

第一作者：马丞(1993-)，男，硕士，主要从事临床医学实验研究。