五鹤续断对衰老小鼠免疫功能的影响

王先丽　陈龙菊

(湖北民族学院科技学院，湖北　恩施　445000)



五鹤续断对衰老小鼠免疫功能的影响

王先丽陈龙菊1

(湖北民族学院科技学院，湖北恩施445000)

〔摘要〕目的观察五鹤续断(WHDA)注射液对衰老小鼠免疫功能的影响。方法昆明种小鼠(雌雄各半)50只，随机分为高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组及对照组，每组10只。对照组按500 mg·kg-1·d-1腹腔注射生理盐水，其他各组注射等量D-半乳糖。高、中及低剂量组在注射D-半乳糖的同时按7.2、3.6及1.8 g·kg-1·d-1腹腔注射WHDA，模型组、对照组注射等量生理盐水。连续饲养30 d后处死小鼠，取出胸腺、脾脏测定指数，酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组小鼠血清中免疫球蛋白(Ig)G、IgM、C3及C4，采用细胞流式仪分析脾细胞主要T细胞亚群。结果模型组小鼠胸腺、脾脏指数明显下降(P<0.05)，WHDA高、中剂量组明显增大(P<0.05)；模型组血清中IgG、IgM及补体C3、C4含量减少显著(P<0.05)，WHDA高、中剂量组增加明显(P<0.05)；模型组CD3+、CD4+及CD44+细胞数量减少显著(P<0.05)，CD8+数量明显增加(P<0.05)，WHDA高、中剂量组CD3+、CD4+细胞数量增加明显(P<0.05)，高剂量组CD8+细胞数量明显降低(P<0.05)，高剂量组CD44+细胞数量明显增加(P<0.05)。结论WHDA对衰老小鼠胸腺、脾脏萎缩有一定的延缓作用，能提高血清中IgG、IgM、C3及C4含量，改善脾脏功能，影响T细胞亚群的比例，对免疫所致衰老有较好的作用。

〔关键词〕五鹤续断；免疫球蛋白；补体

五鹤续断(WHDA)是生长在湖北省五峰县和鹤峰县的川续断科草本植物，又名龙豆，因地理生态环境富硒、产量大、质量优而闻名，是名副其实的道地药材〔1〕，其成分含有三萜皂苷类、挥发油、甾醇类、生物碱、黄酮等有效成分，具有补肝益肾、续接筋骨、抗骨质疏松等功效〔2〕。研究表明，WHDA有清除体内活性氧，减少丙二醛(MDA)产生，提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力，具有抗氧化、抗疲劳及抗衰老等作用〔3～5〕。本文观察WHDA对衰老小鼠免疫功能的影响，从免疫学方面探讨WHDA抗衰老机制。

1材料与方法

1.1材料清结级昆明种小鼠(雌雄各半)，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，4～6周龄，体重(20.6±2.8)g，由常规饲养。

1.2药品及仪器WHDA由湖北省恩施市板桥乡中药材生产基地提供，采用水提醇沉法制成含生药30%(相当于生药含量2 g/ml)的液体,用时以生理盐水稀释成0.4 g/ml，瓶装密封消毒贮存于4℃备用〔5〕。D-半乳糖(Sigma公司)，PE标记的抗大鼠CD3、CD8抗体及(FITC)标记的抗大鼠CD4、CD44抗体(Biolegend公司)，免疫球蛋白(Ig)G、IgM、C3、C4 ELISA试剂盒(晶美公司)，DMEM细胞培养液(美国Gibco公司)，其他分析纯试剂由湖北恩施乐之塬科技公司提供。FA1640型精密电子天平(上海天平仪器厂)，全自动酶标仪(美国Thermo公司)，低温冷冻离心机及流式细胞仪(美国Beckman公司)。

1.3动物分组、造模及给药将清洁级昆明种小鼠(雌雄各半)50只，随机分为高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组及对照组，每组10只。对照组按500 mg·kg-1·d-1腹腔注射生理盐水，其他各组注射等量D-半乳糖〔6〕。高剂量组、中剂量组及低剂量组在注射D-半乳糖的同时按7.2、3.6及1.8 g·kg-1·d-1腹腔注射WHDA，模型组、对照组注射等量生理盐水。各组自由饮食，连续饲养30 d。

1.4胸腺、脾脏指数测定75%乙醇消毒后，小心取出胸腺、脾脏，放入冰冻生理盐水(0.9%)冲洗拭干，迅速用精密分析天平称取重量，测定胸腺、脾脏指数〔胸腺、脾脏重量(mg)/体重(g)〕。

1.5酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测WHDA对小鼠IgG、IgM、C3及C4的影响小心收集小鼠血液于无内毒素、热原的促凝管中，4℃，10 000 r/min离心15 min，于-70℃保存备用。血清中IgG、IgM及补体C3、C4检测参考试剂盒说明书采用双抗体夹心ELISA法。

1.6脾细胞中主要T细胞亚群的分析将取出的脾脏，放入培养皿中，将其周围结缔组织剪除，加入10 mmol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH7.4)反复冲洗后转至200目滤网培养皿中加入5 ml PBS，仔细研磨制成单个细胞悬液。2 000 r/min离心12 min，弃上清后加入5 ml红细胞裂解液，1 500 r/min离心8 min，再弃上层清液，重复3次〔7,8〕。沉淀用无血清Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)培养液离心洗涤3次后重悬于PBS缓冲液中，调整细胞浓度为2×107个/ml，台盼蓝细胞活性检测。依据检测的T细胞亚群的不同，加入50 μl稀释后的用PE标记的抗大鼠CD3、CD8及用FITC标记的抗大鼠CD4、CD44一抗1 μg在相应的流式检测管中，对照管则加入50 μl缓冲液。各管再分别加入50 μl细胞悬液混匀后4℃孵育30 min，离心洗涤3次后取500 μl上流式细胞仪检测分析。

1.7统计学方法使用SPSS18.0软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1WHDA对胸腺、脾脏指数的影响模型组相对对照组，胸腺、脾脏指数明显下降(P<0.05)；WHDA各组与模型组相比较，高、中剂量组胸腺、脾脏指数明显增大(P<0.05)，低剂量组增大不明显，无显著差异(P>0.05)；WHDA各组与对照组相比，高剂量组胸腺、脾脏指数有所增大(P<0.05)，中、低剂量组无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.2WHDA对血清IgG、IgM及补体C3、C4的影响与对照组相比较，模型组小鼠血清中IgG、IgM及补体C3、C4含量减少显著(P<0.05)；WHDA各组与模型组相比较，高、中剂量组血清中IgG、IgM及补体C3、C4含量增加明显(P<0.05)；WHDA各组与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。见表2。

表1　WHDA对各组小鼠胸腺、脾脏指数的影响

与模型组比较：1)P<0.05；与对照组比较：2)P<0.05，下表同

表2　WHDA对血清IgG、IgM及补体

2.3WHDA对脾细胞中主要T细胞亚群的影响与对照组相比较，模型组小鼠CD3+T淋巴细胞、CD4+辅助T淋巴细胞及CD44+记忆性T淋巴细胞数量减少显著(P<0.05)，CD8+细胞毒性T淋巴细胞数量明显增加(P<0.05)；WHDA各组与模型组相比较，高、中剂量组CD3+T淋巴细胞、CD4+辅助T淋巴细胞数量增加明显(P<0.05)，高剂量组CD8+细胞毒性T淋巴细胞数量明显降低(P<0.05)，中、低剂量组CD8+细胞毒性T淋巴细胞数量变化不明显，高剂量组CD44+记忆性T淋巴细胞数量明显增加(P<0.05)；中、低剂量组CD44+记忆性T淋巴细胞数量变化不明显；WHDA各组与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。见表3。

表3　WHDA对各组小鼠脾细胞中主要T细胞

3讨论

衰老是生物自发必然的生理现象，可表现为结构上的退行性变，功能的衰退，适应性及抵抗力下降，目前对衰老有多种假说，其中有免疫学说及中医脾虚衰老学说〔7～9〕。免疫衰老是极为复杂的过程，常常会伴随免疫指标的改变。作为重要免疫器官胸腺、脾脏，对T淋巴细胞和B淋巴细胞的分化、发育、体液免疫及细胞免疫有重要作用，胸腺、脾脏指数常来评价机体的免疫功能〔10，11〕；Ig则是评价机体体液免疫状况的常用指标，其含量多少基本可反映机体免疫应答能力和体液免疫水平，免疫衰老常见的改变还有T细胞和B细胞数量和功能的减退〔12〕。本实验发现WHDA衰老小鼠胸腺、脾脏萎缩有一定的延缓作用，表明WHDA对免疫器官有一定的修复作用，可以通过调节机体免疫器官抗衰老；WHDA能提高衰老小鼠血清中的含量，对提高机体免疫应答能力和体液免疫水平有一定的作用；WHDA可以改善小鼠的脾脏功能，影响T细胞亚群的比例，通过增加不同类型T细胞的数量来增强免疫功能，发挥抗衰老作用。

4参考文献

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4詹光杰.板党、五鹤续断、天麻及头项一颗珠对抗氧化酶表达作用的比较〔J〕.陕西中医,2010;31(6):754-5.

5詹光杰,杨年安,肖本见.五鹤续断抗小鼠衰老的作用及其机制研究〔J〕.中国应用生理学杂志,2014;30(2):174-7.

6王绪平,呙登俊,陈宇,等.Morris水迷宫实验评价血管性痴呆大鼠模型的学习记忆能力〔J〕.中华中医药学刊,2013:31(1):99-100.

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8原江水.白藜芦醇对大鼠的抗衰老作用研究〔D〕.青岛：中国海洋大学,2013：37-52.

9段永强,成映霞,程容.脾虚证进程中小鼠特异性/非特异性免疫功能变化及中药的干预作用〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(24):2874-6.

10孟宪军,杨平,张丽.刺五加苷对D-半乳糖致衰老模型大鼠免疫功能的影响〔J〕.中国老年学杂志,2010;30(2):216-8.

11吴正平.金花葵花总黄酮对衰老模型小鼠抗氧化和免疫功能的影响〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(10):1800-2.

12候茜,郭美,张帆.党参水煎剂对D-半乳糖致免疫衰老小鼠胸腺功能的影响〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,2014;30(1):55-7.

〔2014-12-09修回〕

(编辑冯超/曹梦园)

基金项目：恩施州农业与社会发展科技指导性计划(恩州科业〔2013〕9号)

〔中图分类号〕R285.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)09-2059-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.004

1湖北民族学院医学院

第一作者：王先丽(1980-)，女，硕士，讲师，主要从事病理生理学研究。