肾上腺素对布比卡因抑制大鼠心室肌细胞钠电流的影响

陈鸿飞，刘付丽，吴一泉，徐旭仲（温州医科大学附属第一医院 麻醉科，浙江 温州 325015）



肾上腺素对布比卡因抑制大鼠心室肌细胞钠电流的影响

陈鸿飞，刘付丽，吴一泉，徐旭仲
（温州医科大学附属第一医院 麻醉科，浙江 温州 325015）

［摘 要］目的：研究肾上腺素对较低浓度布比卡因所抑制的大鼠心室肌细胞钠电流（INa）的影响。方法：采用急性酶解分离法获得Sprague-Dawley雄性大鼠心室肌细胞，随机分为2组（n=5），以全细胞膜片钳技术记录INa，观察0.15 μg/mL肾上腺素对40 μmol/L布比卡因和50 μmol/L布比卡因所抑制的INa的影响。结果：40 μmol/L和50 μmol/L布比卡因对大鼠心室肌细胞INa抑制率分别为（50.2%±5.8%）和（62.7%±7.7%），差异有统计学意义（P＜0.05）。当加入0.15 μg/mL肾上腺素后，40 μmol/L布比卡因组抑制率变到（33.7%± 10.2%），差异有统计学意义（P＜0.05）；50 μmol/L布比卡因组抑制率变为（62.1%±7.3%），差异无统计学意义（P＞0.05），肾上腺素对I-V曲线无明显影响。结论：肾上腺素可以部分恢复较低浓度布比卡因所抑制的心室肌细胞INa，但其作用在较高浓度布比卡因中受到限制。

［关键词］布比卡因；肾上腺素；钠电流；心室肌细胞；大鼠

超声引导神经阻滞在临床中得到广泛应用［1-2］，但是并不能完全避免局麻药中毒的发生［3-5］。现局麻药中毒治疗指南将脂肪乳剂作为主要复苏药物，肾上腺素作为重要辅助用药［6］。然而对于肾上腺素应用于局麻药中毒的有效性，尚存争议［7-8］。本课题组已证实肾上腺素可以逆转高浓度布比卡因所抑制的L钙通道电流（ICa-L）和瞬时外向钾电流（Ito），但不能恢复钠电流（INa）［9］。为进一步验证肾上腺素是否可以恢复较低浓度布比卡因所抑制的INa，本研究采用全细胞膜片钳技术，研究肾上腺素对较低浓度布比卡因所抑制的大鼠心室肌细胞INa的影响。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物：Sprague-Dawley雄性大鼠，体质量280～330 g，由温州医科大学实验动物中心提供。1.1.2 实验试剂：盐酸布比卡因粉剂（批号100959 032），I型胶原酶，XIV型蛋白酶，牛血清白蛋白（BSA），N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、乙二醇-四乙酸（EGTA）、氯化铯（Cs Cl）、谷氨酸、牛磺酸、CaCl2、Na2ATP、CsOH为Sigma公司产品。注射用肾上腺素（批号：1104111）为金辉制药有限公司提供。其余化学试剂为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1大鼠心肌细胞急性分离：采用腹腔注射5%水合氯醛7 mL/kg，无反射后迅速开胸取心脏。在4 ℃台氏液（试剂单位均为mmol/L）（NaCl 137、KCl 5.4、CaCl21.8、MgCl21.0、NaH2PO40.33、HEPES 10、Glucose 10，NaOH调pH至7.4±0.5）中去除脂肪和心包膜，分离主动脉并插管到Langendorff心脏灌流装置。用无钙台氏液灌流5 min，再用含1 mg/mL I型胶原酶、0.05 mg/mL XIV型蛋白酶和50 μmol/L CaCl2的无钙台氏液30 mL循环灌流约6～10 min。整个灌流系统温度保持在35～37 ℃，流速10～12 mL/min。所有灌流液和KB液（KCl 40、KH2PO420、MgSO43.0、KOH 80、Glutamate 50、Taurine 20、HEPES 10、Glucose 10、EGTA 0.5，KOH调pH至7.35）均通以100% O2饱和15 min以上。然后将心脏从Langendorff装置上取下，剪下心室部分，放入含10 mg/mL BSA的KB液中，用小剪刀将其剪碎至约1 mm3，再用玻璃滴管充分吹打2～3 min，用100目微孔尼龙膜过滤后，留取滤液室温下稳定1 h后备用。采用急性酶解分离法获得心室肌细胞，保存于KB液中，室温下稳定1 h备用。INa细胞外液（Choline-Cl 140、NaCl 20、MgCl21.0、HEPES 5、Glucose 10、CsCl 4.6，CsOH调pH至7.4）和INa电极内液（CsCl 120、NaCl 10、MgCl21.0、Na2ATP 5.0、EGTA 10、HEPES 10，CsOH调pH至7.3）使用前均预充氧15 min。

1.2.2实验分组：心室肌细胞10个，随机分为2组（n=5）：40 μmol/L布比卡因组和50 μmol/L布比卡因组。40 μmol/L布比卡因组：先记录空白钠通道电压-电流（I-V）曲线（T0），然后灌流含40 μmol/L布比卡因的细胞外液5 min后（T1），记录I-V曲线，再灌流含有40 μmol/L布比卡因和0.15 μg/mL肾上腺素的细胞外液5 min后（T2），记录I-V曲线。50 μmol/L布比卡因组：先记录空白钠通道I-V曲线（T0），然后灌流含50 μmol/L布比卡因的细胞外液5 min后（T1），记录I-V曲线，再灌流含有50 μmol/L布比卡因和0.15 μg/mL肾上腺素的细胞外液5 min后（T2），记录记录I-V曲线。

1.2.3全细胞膜片钳技术测定钠通道I-V曲线：膜片钳放大器（EPC 10，HEKA公司，德国）通过A/D和D/ A数据转换同计算机相连接。刺激信号及电压、电流输入信号的采集均由软件pulse 8.0（HEKA公司，德国）控制。玻璃毛坯（SUTTER公司，美国）经微电极拉制仪（P-97，SUTTER公司，美国）拉制而成，尖端直径1～1.5 μm，入水电阻为1.0～2.5 MΩ。记录INa时细胞内外液中以CsCl代替KCl以消除钾电流对INa的影响。为了降低INa的电流强度以减少钳位误差，降低细胞外液的NaCl浓度至20 mmol/L，其余NaCl成分用Choline-Cl代替以维持渗透压平衡。

1.2.4刺激参数设置和数据采集：记录INa的I-V曲线刺激方案为钳制电位-90 mV，电位从-90 mV开始，以10 mV阶跃刺激至+50 mV，波宽50 ms，刺激频率0.2 Hz。根据INaV曲线结果，得到INa峰值，计算给药后INa电流抑制率。

1.3统计学处理方法 采用SPSS13.0统计软件进行分析，实验数据以±s表示，电流抑制率比较采用配对t检验，不同时间点的电流密度比较采用单因素方差分析及LSD法两两比较，同一时间点的组间电流密度比较采用成组t检验，使用Origin 8.0软件对测量后的数据进行绘图。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1布比卡因对INa峰值的抑制率的作用 所有细胞均在测试电压-30 mv出现INa峰值。40 μmol/L布比卡因组中，40 μmol/L布比卡因对INa峰值抑制率为（50.2%±5.8%），差异有统计学意义（P＜0.05）；50 μmol/L布比卡因浓度组中，50 μmol/L布比卡因对INa峰值的抑制率为（62.7%±7.7%），差异有统计学意义（P＜0.05）。2组电流密度和原始电流图，见表1和图1。

表1　2组INa电流密度给药前后比较（n=5，±s）

表1　2组INa电流密度给药前后比较（n=5，±s）

与40 μmol/L布比卡因组比：aP＜0.05；同组内与T0比：bP＜0.05；同组内与T1比：cP＜0.05

组别　T0（PA/PF）　T1（PA/PF）　T2（PA/PF）40 μmol/L布比卡因组　-26.82±5.06　-13.19±1.29ba　-18.78±3.19bc50 μmol/L布比卡因组　-28.83±6.56　-10.40±0.97ab　-10.61±1.20ab

图1 2组大鼠心室肌的INa原始电流图

2.2肾上腺素对布比卡因所抑制的INa峰值抑制率的作用 给予含0.15 μg/mL肾上腺素的细胞外液后，在40 μmol/L布比卡因组中，INa峰值抑制率变为（33.7%±10.2%），与给药前比差异有统计学意义（P＜0.09）。在50 μmol/L布比卡因组中，INa峰值抑制率变为（62.1%±7.3%），与给药前比差异无统计学意义（P＞0.05）。2组电流密度比较，见表1。

2.3肾上腺素对布比卡因抑制的对I-V曲线的影响

2组INa的激活电压约为-60 mV，峰电流在-30 mV出现，反转电位在+20 mV。40 μmol/L和50 μmol/L布比卡因对所有指令电压条件下均引起INa降低，使I-V曲线上移，但并不改变激活电位和反转电位。在40 μmol/L组中，0.15 μg/mL肾上腺素可使INa有所增加，但对激活电位和反转电位无明显影响，见图2。

图2　肾上腺素对40 μmol/L和50 μmol/L布比卡因存在时钠通道I-V曲线的影响（n=5，±s）

3　讨论

大剂量酰胺类局麻药可造成严重循环虚脱甚至心搏骤停［10］，如不及时抢救，死亡率高，而且复苏后并发症多。酰胺类局麻药的心脏毒性主要表现为心律失常和负性肌力作用。心脏毒性机制可能是布比卡因阻断心肌细胞INa［11］、ICa和IK；干扰心肌细胞线粒体能量代谢等。

近年来静脉注射脂肪乳的应用大大提高了布比卡因所致心搏骤停的复苏率［12-14］，但对于肾上腺素是否能有效提高复苏率和延长生存时间仍未达成共识。Liu等［15］报道了大鼠离体心脏肾上腺素、脂肪乳剂联合使用比单独使用脂肪乳剂或者肾上腺素效果好，但同样有研究［7］表明肾上腺素并不能有效治疗局麻药所致毒性。目前明确的是肾上腺素可以激动心肌传导系统和窦房结的β肾上腺素受体，从而增强心肌收缩力，加快心率，扩张冠脉而有利于解救局麻药毒性。同时β肾上腺素受体激活后可作用于心肌细胞，改变INa、ICa和IK［16］，但肾上腺素通过β肾上腺素受体的激活影响局麻药对心肌离子通道电流抑制的研究很少。

研究发现灌注浓度为40 μmol/L布比卡因可使离体大鼠心脏全部停搏［17］，而灌注浓度为30 μmol/L时，心脏只有部分停搏［15］，因此选择40 μmol/L左右灌注浓度进行研究对肾上腺素在布比卡因所致心搏骤停的应用中具有一定指导意义。本项目组之前研究发现，肾上腺素可以逆转高浓度布比卡因（100 μmol/L）所抑制的L型钙通道电流（ICa-L）和瞬时外向钾离子电流（ITo），但是对INa并无逆转作用［9］。在此基础上，本研究降低了布比卡因浓度，当浓度为50 μmol/L时，肾上腺素同样不能逆转布比卡因所抑制的INa；但再将布比卡因浓度降低到40 μmol/L时，肾上腺素可以部分恢复布比卡因所致的INa峰值抑制。提示当布比卡因在体内的浓度较高时，肾上腺素的复苏效果可能会受到影响。这也可能是在脂肪乳剂应用于局麻药毒性解救前，而仅仅使用肾上腺素，复苏成功率不高的原因之一。研究已经发现β肾上腺素受体的激活可以增强INa，但是肾上腺素如何影响布比卡因对心室肌INa抑制的机制需要进一步研究确定。肾上腺素可以部分恢复较低浓度布比卡因所抑制的INa，但增加布比卡因浓度到一定程度（50 μmol/L）后，这一作用将受到限制。

参考文献：

［1］周日永，徐旭仲. 超声引导腘窝处坐骨神经联合隐神经阻滞用于糖尿病足手术麻醉的效果［J］. 温州医科大学学报，2014，44（11）： 825-828.

［2］唐红丽，耿武军，陈鸿飞，等. 超声引导下环肱动脉神经阻滞在手外伤患者中的临床应用［J］. 温州医科大学学报，2014，44（7）： 536-538.

［3］GIRDLER-HARDY T P，WEBB C，MENON G. Improved safety and efficacy of ultrasound-guided interscalene nerve block vs a nerve-stimulator guided technique［J］. Br J Anaesth，2015，115（3）: 474-475.

［4］BARRINGTON M J，KLUGER R. Ultrasound guidance reduces the risk of local anesthetic systemic toxicity following peripheral nerve blockade［J］. Reg Anesth pain Med，2013，38（4）: 289-299.

［5］SITES B D，TAENZER A H，HERRICK M D，et al. Incidence of local anesthetic systemic toxicity and postoperative neurologic symptoms associated with 12 668 ultrasound-guided nerve blocks: an analysis from a prospective clinical registry［J］. Reg Anesth pain Med，2012，37（5）: 478-482.

［6］NEAL J M，BERNARDS C M，BUTTERWORTH J F 4th，et al. ASRA practice advisory on local anesthetic systemic toxicity［J］. Reg Anesth pain Med，2010，35（2）: 152-161.

［7］HICKS S D，SALCIDO D D，LOGUE E S，et al. Lipid emulsion combined with epinephrine and vasopressin does not improve survival in a swine model of bupivacaine-induced cardiac arrest［J］. Anesthesiology，2009，111（1）: 138-146.

［8］HARVEY M，CAVE G. Bupivacaine-induced cardiac arrest: fat is good-is epinephrine really bad［J］？ Anesthesiology，2009，111（3）: 467-469.

［9］LIU F，WU B，DU Y，et al. Epinephrine reversed high-concentration bupivacaine-induced inhibition of calcium channels and transient outward potassium current channels，but not on sodium channel in ventricular myocytes of rats［J］. BMC Anesthesiol，2015，15: 66.

［10］DILLANE D，FINUCANE B T. Local anesthetic systemic toxicity［J］. Can J Anaesth，2010，57（4）: 368-380.

［11］SCHOLZ A. Mechanisms of （local） anaesthetics on voltage-gated sodium and other ion channels［J］. Br J Anaesth，2002，89（1）: 52-61.

［12］CHEN H，XIA Y，ZHU B，et al. Measurement of the efficacy of 2% lipid in reversing bupivacaine- induced asystole in isolated rat hearts［J］. BMC Anesthesiol，2014，14: 60.

［13］南芙蓓，吴冰晶，董娇娇，等. 左西孟旦提高脂肪乳剂联合肾上腺素解救布比卡因诱导的心脏停搏大鼠的存活率［J］.温州医科大学学报，2015，45（8）： 556-559.

［14］刘乐，陈莺，徐旭仲，等. 脂肪乳剂对布比卡因诱导的离体大鼠心脏停搏的复苏作用［J］. 温州医科大学学报，2009，39（1）： 31-35.

［15］LIU L，XIA Y，CHEN Y，et al. The comparative effects of lipid，epinephrine，and their combination in the reversal of bupivacaine-induced asystole in the isolated rat heart［J］. Anesth Analg，2012，114（4）: 886-893.

［16］CHRIST T，GALINDO-TOVAR A，THOMS M，et al. Inotropy and L-type Ca2+ current，activated by beta1- and beta2-adrenoceptors，are differently controlled by phosphodiesterases 3 and 4 in rat heart［J］. Br J pharmacol，2009，156（1）: 62-83.

［17］CHEN Y，XIA Y，LIU L，et al. Lipid emulsion reverses bupivacaine-induced asystole in isolated rat hearts: concentration-response and time-response relationships［J］. Anesthesiology，2010，113（6）: 1320-1325.

（本文编辑：吴彬）

Effect of epinephrine on inhibition of sodium current induced by bupivacaine in ventricular myocytes of rats

CHEN Hongfei，LIU Fuli，WU Yiquan，XU Xuzhong. Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015

Abstract:Objective: To determine the effect of epinephrine on inhibition of sodium current （INa） induced by bupivacaine inventricular myocytes of rats. Methods: The ventricular myocytes isolated from Sprague-Dawley rats by acute enzymatic dissociation were randomly divided into two groups （n=5）. The whole-cell patch clamp technique was used to record INain single ventricular myocytes and the effect of 0.15 ug/mL epinephrine inhibition of INaon induced by 40 or 50 μmol/L bupivacaine were observed. Results: The inhibition rates of 40 μmol/L bupivacaine or 50 μmol/L bupivacaine on INawas 50.2%±5.8 % or 62.7%±7.7 % （P＜0.05） respectively. After the administration of 0.15 ug/mL epinephrine，the inhibition rates in the 40 μmol/L bupivacaine group changed to be 33.7%±10.2 % （P＜0.05），and which was 62.1%±7.3% （P＞0.05） in the 50 μmol/L bupivacaine group. Epinephrine did not shift the I-V curve. Conclusion: Epinephrine can reverse inhibition of INainduced by low-concentration bupivacaine. This effect of epinephrine will be limited to a higher level concentration of bupivacaine.

Key words:bupivacaine； epinephrine； sodium current； ventricular myocytes； rats

通信作者：徐旭仲，教授，Email：xuzhong@263.net。

作者简介：陈鸿飞（1986-），男，湖南邵阳人，住院医师，硕士。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81470419）；浙江省科技厅国际科技合作专项（合作研究）项目（2012C24018）；温州市科技局科研基金资助项目（Y20150239）。

收稿日期：2015-12-25

［中图分类号］R614

［文献标志码］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.003