NK-2受体参与小鼠断尾诱发的扣带回前部神经元Fos蛋白表达

张雅娟，杨宇，李娜然，商丽宏，吴孟霏，吴敏范*

(1.沈阳市第五人民医院神经内科，辽宁沈阳110023；2.沈阳医学院基础医学院生理学教研室；3.沈阳医学院基础医学院形态学实验室；4.辽宁何氏医学院)



NK-2受体参与小鼠断尾诱发的扣带回前部神经元Fos蛋白表达

张雅娟1，杨宇2，李娜然3，商丽宏2，吴孟霏4，吴敏范2*

(1.沈阳市第五人民医院神经内科，辽宁沈阳110023；2.沈阳医学院基础医学院生理学教研室；3.沈阳医学院基础医学院形态学实验室；4.辽宁何氏医学院)

[摘要]目的：探讨小鼠断尾能否改变扣带回前部(anterior cingulate gyrus，ACG)神经元Fos蛋白表达及NK-2受体在此变化中的作用。方法：采用免疫组织化学方法观察截断小鼠尾末端2.5 cm后0.5 h小鼠ACG神经元的Fos蛋白表达变化及蛛网膜下腔注射MEN-10,376(NK-2受体拮抗剂)对该变化的影响。结果：小鼠截断尾后0.5 h，ACG神经元的Fos蛋白表达显著增强；蛛网膜下腔注射MEN-10,376完全拮抗了截断尾诱发的ACG神经元的Fos蛋白表达显著增强，差异均有统计学意义。结论：中枢NK-2受体参与小鼠截断尾引起ACG神经元的Fos蛋白表达显著增强过程。

[关键词]幻肢痛；扣带回前部；Fos蛋白；MEN-10,376；NK-2受体

幻肢痛(phantom limb pain，PLP)是截肢患者主观感觉已经被切除的肢体仍然存在，并伴有不同程度及不同性质疼痛的现象。有研究报道，60%以上截肢患者术后伴有PLP[1]；扣带回前部(anterior cingulate gyrus，ACG)是重要的痛觉中枢之一[2-3]；PLP患者的ACG神经元活动发生明显的改变[4]；大鼠截肢后ACG对中枢刺激及外周刺激反应增强[5]；手术截断小鼠尾末端常用于研究PLP产生的中枢机制[6-7]。目前，PLP发病机制尚不清楚。研究表明c-fos即刻早基因及Fos蛋白表达标志着伤害性信息传导通路中伤害性感受神经元兴奋[8]，速激肽NK-2受体参与下肢皮下注射福尔马林作为痛刺激引起的室旁核神经元Fos蛋白表达显著增加的过程[9]。但是，截断小鼠尾末端能否引起ACG神经元Fos蛋白表达的改变及速激肽NK-2受体是否参与该过程尚未见报道。本实验应用免疫组织化学法对此进行研究，以期阐明速激肽NK-2受体在伤害性信息传递和调制中的作用，深入研究PLP的产生机制，为临床治疗PLP提供科学实验依据。

1材料与方法

1.1实验动物成年昆明种小鼠24只，雌性，体重(27±6)g，由沈阳医学院实验动物中心提供(动物生产许可证号：SCXK(辽)2010-0001)。MEN-10,376(Sigma，美国)，DAB试剂盒、ABC试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2分组及给药方法小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)麻醉后，随机分为4组，各6只。空白对照组；断尾后0.5 h组(即用手术剪刀截断小鼠尾末端2.5 cm后0.5 h实验组)；MEN-10,376(NK-2受体拮抗剂)组(将MEN-10,376 10 μg混于10 μl生理盐水中蛛网膜下腔注射后10 min截断小鼠尾末端2.5 cm后0.5 h实验组)；生理盐水组(同体积生理盐水蛛网膜下腔注射后10 min截断小鼠尾末端2.5 cm后0.5 h对照组)。

1.3ACG神经元Fos蛋白表达检测迅速将上述各组小鼠断头，在冰台上取脑，置入4 ℃ 4%多聚甲醛中过夜固定。连续冠状-20 ℃冰冻切片，厚度为15 μm，采用免疫组化法常规染片及洗片等，最后采用树胶封片。使用显微图像分析仪检测切片ACG神经元Fos蛋白表达阳性细胞积分光密度和面积百分比。

2结果

与空白对照组比较，断尾后0.5 h组、生理盐水组ACG神经元的Fos蛋白表达阳性细胞积分光密度及面积百分比均显著增加(P<0.01)；MEN-10,376组ACG神经元的阳性细胞积分光密度及面积百分比无明显增加(P>0.05)。与断尾后0.5 h组、生理盐水组比较，MEN-10,376组ACG神经元Fos蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表1、图1。

表1　MEN-10,376蛛网膜下腔注射对截断尾

注：与空白对照组比较，1)P<0.01；与断尾后0.5 h组、生理盐水组比较，2)P<0.05

A：空白对照组；B：断尾后0.5 h组；C：生理盐水组；D：MEN-10,376组图1　4组小鼠ACG神经元Fos蛋白的表达(免疫组化染色，×400)

3讨论

研究发现，作为中枢神经系统对刺激产生反应的疼痛标志物Fos蛋白的表达，标志着伤害性感受神经元兴奋，Fos蛋白表达的部位常常是与伤害性传入信息传递、整合等有关的区域[8]；截肢的大鼠ACG神经元活动发生明显改变[5]。本实验观察到在空白对照组ACG神经元有少量的Fos蛋白表达；截断小鼠尾末端后0.5 h ACG神经元Fos蛋白表达显著增加。因此，我们认为在正常情况下ACG神经元存有Fos蛋白较低水平的表达；ACG神经元能够感受小鼠断尾传入的伤害性信息，引起Fos蛋白表达显著增加，ACG神经元参与断尾后中枢神经系统的可塑性变化。本实验结果为深入研究PLP提供了实验依据。

PLP是截肢患者常见的并发症之一。目前，关于PLP产生的原因尚不清楚，无理想的治疗方法。速激肽NK-2受体与痛觉有关[10]。但是，截断尾末端增加ACG神经元的Fos蛋白表达过程是否有NK-2受体参与尚未见报道。本实验观察到NK-2受体拮抗剂MEN-10,376能够拮抗截断尾末端引起的ACG神经元Fos蛋白表达显著增加，提示中枢NK-2受体参与了截断尾末端引起的ACG神经元Fos蛋白表达的显著增加过程，NK-2受体可能为治疗PLP的潜在靶点之一。

参考文献：

[1]Richardson C，Crawford K，Milnes K，et al.A clinical evaluation of postamputation phenomena including phantom limb pain after lower limb amputation in dysvascular patients[J].Pain Manag Nurs，2015，16(4):561-569.

[2]Barthas F，Sellmeijer J，Hugel S，et al.The anterior cingulate cortex is a critical hub for pain-induced depression[J].Biol Psychiatry，2015，77(3)：236-245.

[3]Navratilova E,Xie JY,Meske D,et al.Endogenous opioid activity in the anterior cingulate cortex is required for relief of pain[J].J Neurosci,2015,35(18):7264-7271.

[4]Kringelbach ML,Jenkinson N,Green AL,et al.Deep brain stimulation for chronic pain investigated with magnetoencephalography[J].Neuroreport,2007,18(3):223-228.

[5]Li J， Wu M， Zhuo M，et al.Alteration of neuronal activity after digit amputation in rat anterior cingulate cortex[J].Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol，2013，5(1):43-51.

[6]Zhuo M.Cortical depression and potentiation:basic mechanisms for phantom pain[J].Exp Neurobiol,2012,21(4):129-135.

[7]商丽宏,代秋竹,陈奎敏，等.CNQX对截断尾末端后小鼠痛反应变化的影响[J].中国医科大学学报,2011,40(1):48-49，52.

[8]Mattson MP.Excitotoxic and excitoprotective mechanisms:abundant targets for the prevention and treatment of neuro-degenerative disorders[J].Neuromolecular Med,2003,3(2):65-94.

[9]Culman J，Das G，Ohlendorf C,et al.Blockade of tachykinin NK1/NK2 receptors in the brain attenuates the activation of corticotrophin-releasing hormone neurones in the hypothalamic paraventricular nucleus and the sympathoadrenal and pituitary-adrenal responses to formalin-induced pain in the rat[J].Neuroendocrinol，2010，22(5)：467-476.

[10]Michalski CW,Shi X，Reiser C,et al.Neurokinin-2 receptor levels correlate with intensity,frequency,and duration of pain in chronic pancreatitis[J].Ann Surg，2007，246(5):786-793.

(文敏编辑)

NK-2 Receptor Involved in Fos Protein Expression of Anterior Cingulate Gyrus Neurons Evoked by Amputation of the Tail Extremity of Mice

ZHANG Yajuan1,YANG Yu2,LI Naran3,SHANG Lihong2,WU Mengfei4,WU Minfan2*

(1.Department of Neurology，The Fifth People's Hospital of Shenyang，Shenyang 110023,China；2.Department of Physiology，Shenyang Medical College；3.Laboratory of Morphology，Shenyang Medical College；4.He University)

[Abstract]Objective:To approach whether amputation of tail extremity of mice could evoke Fos protein expression change in ACG neurons and the role of NK-2 receptor in the change.Methods:Immunohistochemistry method was used to study Fos protein expression change in mice ACG neurons at 0.5 h after amputation of the tail extremity 2.5 cm,and effect of NK-2 receptor antagonist MEN-10,376(intrathecal injection) on the change.Results:Fos protein expression in mice ACG neurons significantly increased at 0.5 h after the amputation.MEN-10,376 completely antagonized the significant increase in Fos protein expression in mice ACG neurons after the amputation.There were significant differences.Conclusions:Amputation of the tail extremity can significantly increase the Fos protein expression of mice ACG neurons.Central NK-2 receptors are involved in the process.

[Key words]phantom limb pain；anterior cingulate gyrus；Fos protein；MEN-10,376；NK-2 receptor

[收稿日期]2015-12-25

doi:10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.02.002

[中图分类号]R338；Q432

[文献标识码]A

[文章编号]1008-2344(2016)02-0068-02

[作者简介]张雅娟(1969—)，女(汉)，硕士，主任医师，研究方向：痛觉及镇痛机制．[通讯作者]吴敏范(1963—)，女(满)，博士，教授，研究方向：痛觉及镇痛机制．E-mail：minfanwu0594@sina.com.cn

[基金项目]沈阳市科技局计划项目(No.F13-220-9-45)；辽宁省科技厅基金项目(No.L2015020391)