疫苗在水生动物疾病预防中的作用及应用前景（二）

文/王玉堂



疫苗在水生动物疾病预防中的作用及应用前景（二）

文/王玉堂

用药指导

(上接2016年 第4期)

三、我国水产疫苗在水产养殖病害防治中的应用前景

首先需要说明的是，鱼类具有较健全的免疫器官和组织，也具有一系列的免疫细胞，这些都是对鱼类实施免疫预防各种疾病的免疫基础。鱼类免疫器官和组织主要有胸腺、肾脏和黏膜淋巴组织等，这些是鱼类最主要的免疫器官和组织；其次还有参与免疫应答或与免疫应答有关的，统称为免疫细胞。鱼类的免疫细胞还可分为两大类，即淋巴细胞和吞噬细胞。淋巴细胞主要参与特异性免疫应答，在免疫应答中起核心作用。一类免疫细胞主要存在于免疫器官、组织及血液、淋巴中。因为鱼类有较为健全的免疫系统，这也就是应用鱼用疫苗预防疾病的基础。全世界已有100多种鱼用疫苗的商业化生产和应用，说明利用疫苗进行鱼类的疾病预防具有广泛的市场的应用效果。

我国养殖的鱼类种类很多，而且一些常规养殖品种的年产量巨有感，一旦开发成功相应的鱼用疫苗，其应用市场也是非常巨大的。鱼用疫苗的开发与应用，可有效预防细胞性疾病，减少抗生素类药物用量，即能有效降低用药成本，又能解决药物残留之水产品质量安全问题，还可降低水产品消费者通过食物链而产生耐药性风险。

我国随着加入WTO渔业新形势的变化和人们对食品质量的需求，农业部先后出台了无公害水产品养殖规范、禁用渔药物清单等系列与水产品安全相关的行动计划。疫苗可使鱼类高特异抵御病原的攻击，这对占我国水产养殖病害总损失达80%以上、并由细菌、病毒和寄生虫等病原为主致病的海、淡水养殖鱼类而言，疫苗开发与应用的意义极为重大。由水产动物疫苗等免疫制剂替代危害性大的化学药品已势在必行，此类绿色、环保产品大有在3年～5年后成为我国水产养殖业抗病的明星产品的希望。

（一）消除水产品药物残留隐患急需水产疫苗的开发

长期以来，我国水产疫病的控制主要依靠使用各种抗生素和化学药物，但大量使用药物的后果令人担忧,已严重危及环境和人体健康。目前生产上使用渔药大部分由兽药、农药移植而来，缺乏对药效学、药物代谢动力学、毒理学及对养殖生态环境的影响等基础理论的研究；药物的临床验证工作未受到足够的重视，药物的给药剂量、用药程序、休药期缺乏科学依据，导致滥用、错用渔药的情况十分普遍。此外我国缺乏快速、简便的实用性诊断技术，难以做到对症下药或对因施药，盲目用药现象极为严重。长期滥用药物违背人们所倡导的健康养殖宗旨，不仅药物的使用效果受到了限制，延误治病，造成大量死亡和药物投入的双重损失；还可诱发细菌基因突变或转移而产生抗药性，导致无药可用；更严重的是药物在养殖动物体内残留和养殖环境的严重污染，我国水产品药物残留量超标出口受阻的教训极为惨重，养殖业赖于持续发展的某些生态资源枯竭化。随着人们对抗菌素等药物使用的安全性日益重视，认识已从以前的“靶动物安全”到“人类食品安全”和“环境安全”。鉴于此，当前开展“消除水产品药物残留隐患的抗病技术研究”已显得尤为重要，急需水产疫苗的开发应用。

（二）水产疫苗的抗感染特性有广泛的作用范围

随着水产养殖业的高速发展，近20年来，我国水产养殖品种的疫病频繁发生，经济损失严重，据不完全统计，全国每年水产养殖以疫病为主的病害发病率达50%以上，损失率20%左右，年经济损失数百亿元之巨，并且还有上升的趋势，显然，疫病是水产养殖业发展的重大制约因素之一。根据疫苗的作用原理和大量的研究数据表明，水产疫苗适用于鱼类、爬行类和两栖类等脊椎动物，并特异性地针对病毒、细菌和寄生虫等病原的感染。2004年中国水产养殖病害监测报告显示，我国水产病害各类养殖对象损失比例中，鱼类占80%以上（图2），各类型病害比例中病毒、细菌和寄生虫分别占12.4%、41.4%、和26.9%共达80%以上（图3），表明疫苗的作用范围广，在预防我国水产养殖传染病将有良好的应用前景。

图2　2004年我国水产病害各类养殖对象损失比例

图3　2004年我国水产养殖各类型病害比例

（三）水产动物免疫研究得到关注，产品研究储备状态良好

近年来，水产动物免疫研究成为热点，得到了国家自然科学基金、973计划、863计划、攻关计划以及省部等科技计划的资助，加上分子技术的应用，一些重要养殖对象的疫苗研究有了飞跃式的进展。在水产动物免疫学基础方面，开展了海水鱼、鳜鱼等免疫球蛋白发生发育学、鳜粘膜抗体特性及其免疫应答规律、施氏鲟体液免疫及调控机制、水生实验动物剑尾鱼免疫评价模型建立——免疫调节和免疫遗传基因MHC研究等；在病原功能基因方面，获取了大菱鲆虹彩病毒、鳜鱼病毒和鱼类神经坏死病毒的主衣壳蛋白(MCP)基因、鲤春病毒血症病毒囊膜蛋白基因、弧菌外膜蛋白基因和毒素基因等，并进行了基因的克隆、高效表达与功能分析。部分疫苗已进入实验室鱼体保护性试验和田间有效性试验阶段（表3），并且疫苗的研究向浸泡甚至是口服等易于疫苗施予、低成本工厂化生产工艺的方向努力。可以预见，这些阶段性成果的进一步熟化，可在未来的3年～5年将有系列疫苗产品逐步实现商品化，将在我国水产养殖生产病害防治中发挥重大作用。

（四）嗜水气单胞疫苗研究取得新进展

嗜水气单胞菌的致病范围十分广泛，可引起水产养殖鱼类的赤斑病、打印病、腐皮病，对虾败血症，蛙类的红腿病，鳖类的穿孔病等。嗜好水气单胞菌可产生许多致病因子，目前已确证的毒力因子有气溶素、溶血素细胞毒性肠毒素、胞外蛋白酶、载铁体、s层蛋白及Ⅳ型菌毛等，其中胞外酶是重要的致病因子之一。

1.免疫机制

从非特异性细胞免疫角度看，嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌启动了巨噬细胞的吞噬活动，它们的表面蛋白层保护菌体免于吞噬细胞破坏，从而为细菌在体内扩散、进入细胞内繁殖和形成病灶提供了条件。关于嗜水气单胞菌体液免疫机制的研究尚不全面，一些学者的研究表明，不同种类的水产动物对嗜水气单胞菌的抵抗力有所差别，在对青、鲢、鳙四大家鱼的抵抗力研究中得出嗜水气单胞4种鱼的半致死浓度存在着显著差异。此外，同一种动物的不同养殖品种对嗜水气单胞菌的抵抗力也存在着差异。

2.疫苗种类

嗜水气单胞菌疫苗于1993年冬季开始在浙江、江苏、湖北、河北等省广泛使用。试验对象包括鲫、鲢、鳙等种类，到目前为止，已累积试验和推广应用疫苗5万亩以上。疫苗的应用有效地预防了嗜水气单胞菌败血症的发生和流行，每年由此而减少的经济损失上千万元。

全菌灭活疫苗：来活疫苗是指利用某种方式灭活烈性野生病原的感染性，但保留其免疫原性而制备的疫苗。制备方法是通过细胞或生物接种，大量扩增和收集病原体，然后以物理或化学方法，在确保免疫活力的情况下，将病原灭活。

研究表明，嗜水气单胞菌热灭活苗直接浸浴免疫能够引进鱼类局部的粘膜免疫应答。陈月英等（1996）用福尔马林灭活的嗜水气单胞菌强毒株的全菌苗、胞外产物苗和菌体破碎苗分别免疫鲫鱼后的结果可见，全菌苗注射免疫保护率为100%，破碎菌体苗的保护率为80%，以全菌苗最佳。相比之下，减毒活疫苗由于其具有回复农历变致病的缺点而几乎不被应用于生产中。丁诗华等（2007）用聚乳酸——乙醇酸共聚物包裹嗜好水气单胞菌全菌后通过口服法诱导草鱼的免疫应答，发现鱼体可以产生血清型抗体应答和粘膜抗体应答2种免疫应答机制。

表3　我国正在研究的水产疫苗产品

亚单位疫苗：亚单位疫苗即通过提取病原的某些成分制备成的疫苗。如病毒的衣壳蛋白、包膜糖蛋白、细菌的外膜蛋白、脂多糖（LPS）、外毒素、胞外蛋白酶等。亚单位疫苗的优点是除去了病原核酸，避免抗原间的竞争，提高了免疫效果；因此具有接种剂量小、免疫原性强的优点。董传甫等（2005）制备了嗜水气单胞菌主要外膜蛋白免疫刺激复合物亚单位疫苗，腹腔注射免疫欧洲鳗鲡，结果表明，10倍半致死剂量的攻击的免疫保护率为80%以上，且没有明显的血清型特异性。

基因工程疫苗：基因基因疫苗包括基因工程亚单位疫苗、活载体疫苗核酸疫苗和多肽疫苗等，是随着分子生物学技术，特别是DNA重组技术的发展而出现的一类新型疫苗。在鱼类基因工程疫苗上，陈怀青等（1997）进行了嗜水气单胞菌HBC毒素基因的克隆及酶谱分析，为基因工程疫苗的研制提出了目的基因片段。谢俊锋等（2002）用嗜水气单胞菌外膜蛋白ompTS基因在大肠杆菌中获得表达，表达产物稳定，且表达量高达51%，具有原外膜蛋白的免疫原性。

3.发展前景

目前，我国在全菌疫苗、减毒疫苗和菌体成分亚单位疫苗的制备上已经取得了一些科研成果，但因嗜水气单胞菌血清型众多，不同地区、不同鱼种类分离的菌株差异明显，灭活疫苗使用剂量大，机体的免疫应答水平低，弱弱毒苗存在毒力反应强等原因而导致免疫效果不佳。近几年针对嗜水气单胞菌的保护性抗原基因构成的基因工程疫苗以及更新一代的核酸疫苗，都具有较好地免疫效果，但仍处于试验阶段，尚无商品化的疫苗投放市场，因此，开发新型疫苗以针对多种血清型菌株仍是今后防治嗜水气单胞菌性疾病的重要方向。

四、鱼类免疫佐剂的研究及其前景

近几十年来，随着鱼用疫苗的研发和应用，与鱼用疫苗密切相关的鱼用免疫佐剂的研究也越来越受到重视。随着疫苗的研发不断深入，特别是分子生物学技术的迅速发展，研制出的新型工程疫苗纯度高、特异性强，免疫原性相对较差，难以产生有效的免疫应答，需要佐剂来增强其免疫原性或宿主对抗原的保护性应答。其中常用的佐剂有：

1.铝盐佐剂 铝盐佐剂能含油吸附抗原缓慢释放、较长时间刺激免疫细胞，增强机体的体液免疫反应。

2.油性乳剂 弗氏佐剂是含油的一种，其最大特点是具有较强的免疫增强效应，是应用最为广泛的实验用佐剂。

3.微生物佐剂 微生物佐剂主要有脂多糖、分枝杆菌等。

4.天然来源及中草药佐剂 人们发现许多中药的活性成分，如苷类多糖等有很好的免疫调节作用。

免疫佐剂是生物反应调节剂中的免疫调节剂，非特异性免疫刺激作用是使机体产生保护性免疫应答所必需的基本条件，如果这种作用过度或过强，必然会出现毒副作用。以上所述的佐剂种类很多，效果也是确定的，但也有一些不可避免的缺点，如油性佐剂存在粘滞性、稳定性及注射局部反应等问题，氢氧化铝不足以诱导弱抗原的免疫反应，且不能诱导细胞介导的免疫。

理想的佐剂是以最小的免疫刺激可引起适当的免疫促进作用，且无不良反应。中药与合成药物相比较，具有不良反应少、毒副作用小、多效性、双向调节性和无依赖性的特点。因此，具有免疫调节活性，可增强机体免疫力的中药正在成为理想的新型疫苗佐剂。中药对免疫系统发挥多方面的重要调节作用，它不仅能激活T细胞、B细胞、巨噬细胞（M5）、自然杀伤细胞（NK）、细胞毒细胞（CTL）、淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）等免疫细胞，还能活化补体，促进细胞因子生成。其中，中药有效单体免疫佐剂有许多优点：一是成份单一，容易阐明作用机制；二是相互干扰少；三是分子结构明确（可以进一步研究结构与功能的关系，通过结构改造、化学修饰等方法有望开发出更好的佐剂）；四是量效关系、质量标准控制十分容易。中药提取分离技术的进步，为中药单体佐剂的开发创造了条件。

中药免疫佐剂虽然在安全性质方面表现出一定的优越性，但是在作用机理方面的研究去显得十分薄弱。目前，中药免疫佐剂作用机理主要从中药免疫佐剂对免疫系统的免疫器官、免疫细胞及免疫因子的作用来阐述其免疫佐剂的作用机理。但是，中药免疫佐剂是通过什么方式影响免疫系统的，还有待于进一步研究。只有在了解作用机理的基础上，才能更加合理地开发使用中药免疫佐剂。随着对免疫系统的深入认识的分子受体机制的了解，在分子受体层面上阐述中药佐剂作用机制是必要的中药医理论、免疫调节、中药免疫佐剂作用机理等方面的理论研究成果，将使得中药佐剂的开发更加高效，进而研制成具有实际应用价值的高效、低毒、经济的新型中药免疫佐剂。

（未完待续）

作者单位：全国水产技术推广总站