热休克蛋白70对HBV复制的影响*

周洪钟， 刘 波， 任吉华， 陶娜娜， 陈 祥， 李宛蔚， 陈 娟

(重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室，重庆 400016)

热休克蛋白70对HBV复制的影响*

周洪钟， 刘 波， 任吉华， 陶娜娜， 陈 祥， 李宛蔚， 陈 娟△

(重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室，重庆 400016)

目的： 探讨过表达热休克蛋白70(HSP70)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法: 运用RT-qPCR检测HBV复制对HSP70表达的影响及过表达HSP70对HBV 3.5 kb mRNA的影响；运用Western blot法验证HSP70过表达效果及过表达HSP70对HBV核心蛋白的影响；RT-qPCR和Southern blot法分析过表达HSP70对HBV复制中间体的影响；运用双萤光素酶报告系统检测过表达HSP70对HBV启动子活性的影响。结果：HBV复制显著抑制HSP70的mRNA水平。过表达HSP70 抑制HBV复制中间体、3.5 kb mRNA以及核心蛋白的表达，同时抑制HBV核心启动子的活性。结论：HBV复制抑制HSP70的表达。过表达HSP70 抑制HBV的复制。本研究结果表明，HSP70通过抑制核心启动子的活性抑制HBV的复制。

热休克蛋白70； 乙型肝炎病毒

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是严重的公共卫生问题之一，全世界约有20亿人感染HBV，其中约有3亿5 000万人是慢性感染者[1-3]。HBV感染可以引起一系列与HBV相关的肝脏疾病，包括急性或慢性肝炎、肝硬化和肝癌[4]。目前，用于治疗乙型肝炎的主要药物包括干扰素和核苷类似物，然而它们都不能有效消除HBV感染[5]。因此迫切需要探索新的治疗乙型肝炎的方案。

热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是一类属于热休克蛋白家族的分子伴侣，是一种由应激诱导的保护细胞免受各种环境损害的高度保守蛋白质，其在蛋白质或多肽的折叠、组装、转位中起着重要的作用[6-9]。有文献报道，HSP70是天然免疫系统的预警信号，与免疫性疾病有关[10]；HSP70也是一种强有力的抗凋亡蛋白，通过调节凋亡途径参与肿瘤形成并调节肿瘤细胞增殖和存活[1-12]；此外，HSP70还可以通过抑制甲型流感病毒核糖核蛋白的活性从而抑制病毒的转录和复制[13]。这些发现提示HSP70与病毒感染存在某种关系，但是HSP70与HBV感染之间的直接关系没有被确定。因此，本课题将通过在HepG2.2.15和HepAD38 2种HBV复制细胞系中过表达HSP70来探究HSP70对HBV复制的调控作用。

材 料 和 方 法

1 细胞和质粒

HepG2.2.15、HepAD38和HepG2细胞购于ATCC；HBV复制质粒pCH9/3091由第三军医大学林兰教授惠赠；pGEM-HBV1.3由德国海德堡大学Protzer教授赠送；HSP70质粒购于OriGene。

2 主要试剂

HSP70抗体购于Santa Cruz；HBV核心蛋白(HBV core protein,HBc)抗体购于Dako；抗GAPDH抗体购于CST；MEM液体培养基购于Corning；胎牛血清购于Gibco；转染试剂LipofectamineTM2000、TRIzol试剂购自Invitrogen；iScriptTMcDNA合成试剂盒购于Bio-Rad；实时荧光定量PCR荧光染料SYBR Green购于Roche。双萤光素酶报告系统检测试剂盒购于Promega。

3 主要方法

3.1 细胞培养和转染 HepG2细胞培养于含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素的MEM培养基中。HepG2.2.15和HepAD38细胞培养于含有10%胎牛血清、400 mg/L G418的MEM培养基中。所有细胞在5% CO2、37 ℃培养箱中常规培养。质粒转染按说明书操作。

3.2 Western blot实验 转染后4 d，用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞；取30 μg 细胞总蛋白于10% 的SDS-PAGE中分离蛋白；电泳后蛋白转移至硝酸纤维素膜；5%脱脂牛奶封闭膜1 h，然后再4 ℃过夜孵育相应的 I 抗(用封闭液按1∶2 000稀释)；TBST洗膜3次后，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠 II 抗(用封闭液按1∶3 000稀释)室温孵育2 h；TBST洗膜3次后，用ECL试剂显影。

3.3 HBV复制中间体提取和Southern blot实验 转染后5 d，用0.5 mL裂解缓冲液[10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、1 mmol/L EDTA、1% NP-40、2% sucrose]在37 ℃裂解细胞15 min，离心去除细胞碎片；在上清中加入4×104U/L DNase I和10 mmol/L MgCl237℃孵育4 h；然后加入200 μL 35% PEG-8000(含1.5 mol/L NaC1)，冰浴1 h；4 ℃、12 000 ×g离心5 min，弃上清；加入500 μL蛋白酶K消化液[0.5% SDS、150 mmol/L NaCl、25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、10 mmol/L EDTA],45 ℃过夜；然后用酚氯仿抽提，异丙醇沉淀，70% 乙醇洗涤，TE缓冲液或ddH2O溶解HBV复制中间体。提取出的HBV复制中间体经0.9%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后将凝胶在含有0.5 mol/L NaOH和1 mol/L NaCl 的变性液中变性30 min，然后将DNA样本转移到尼龙膜，进行紫外交联和预杂交，预杂交后将膜在含有地高辛标记的HBV特异性探针的杂交液中42 ℃过夜孵育，用CSPD化学发光。

3.4 RT-qPCR实验 按照SYBR Green说明书配制体系进行HBV复制中间体定量检测。HBV的特异性上游引物为5’-CCTAGTAGTCAGTTATGTCAAC-3’，下游引物为5’-TCTATAAGCTGGAGGAGTGCGA-3’。采用TRIzol试剂盒提取各组细胞的总RNA。采用iScriptTMcDNA合成试剂盒合成cDNA。参照SYBR Green试剂盒实验操作说明以β-actin为内参照进行RT-qPCR。HSP70的上游引物为5’-GCAAAGAACACAGTCCAAGG-3’，下游引物为5’-CCTGTAGGCAACTGCACAAT-3’；HBV 3.5 kb mRNA的上游引物为5’-GCCTTAGAGTCTCCTGAGCA-3’，下游引物为5’-GAGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3’；β-actin的上游引物为5’-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3’，下游引物为5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’。

3.5 萤光素酶报告基因检测 细胞培养至融合度为80%，将重组双萤光素酶报告载体pGL3-Sp1、pGL3-Sp2、pGL3-Xp和pGL3-Cp与HSP70或vector共转染至HepG2.2.15和 HepAD38细胞中，表达海肾萤光素酶的pRL-TK载体作为内参照。细胞培养36 h后，严格按照双萤光素酶报告系统检测试剂盒提供的说明书操作。

4 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，两样本均数比较采用t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异(LSD)法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HSP70在HBV复制细胞系中的表达水平

首先我们比较了HSP70在HepG2、HepG2.2.15以及HepG2瞬时转染HBV表达质粒pCH9/3091和pGEM-HBV1.3细胞中的表达水平。RT-qPCR检测发现HSP70 的 mRNA水平在HBV表达细胞系中显著低于对照组，差异有统计学显著性(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The expression of HSP70 in HBV-expressing cells. The mRNA levels of HSP70 were detected by RT-qPCR in HepG2, HepG2.2.15, and HepG2 cells transfected with pCH9/3091 or pGEM-HBV1.3. Mean±SD.n= 3.*P<0.05vsHepG2 group;#P<0.05vspcDNA3.1 group.

图1 HSP70在HBV表达细胞系中的表达水平比较

2 过表达HSP70对HBV复制的影响

为了探讨HSP70对HBV复制的影响，我们在HepG2.2.15和HepAD38细胞中瞬时转染表达HSP70的质粒。Western blot法验证HSP70过表达是成功的，见图2。RT-qPCR检测发现，HBV复制中间体水平在HSP70过表达组显著低于对照组，差异有统计学显著性(P<0.05)，Southern blot实验证实在过表达HSP70后，HBV复制中间体的水平显著降低，见图3。RT-qPCR检测发现过表达HSP70抑制HBV 3.5 kb mRNA的表达，差异有统计学显著性(P<0.05)，见图4。Western blot实验结果也发现过表达HSP70能下调HBV核心蛋白的表达水平，见图5。

Figure 2.The overexpression efficiency of HSP70 in HepG2.2.15 and HepAD38 cells was confirmed by Western blot.

图2 Western blot法验证HepG2.2.15和HepAD38细胞系中HSP70过表达效果

Figure 3.The effect of HSP70 overexpression in HepG2.2.15 and HepAD38 cells on HBV DNA replicative intermediates was analyzed by RT-qPCR (A) and Southern blot (B), respectively. M:marker; rcDNA:relaxed-circular DNA; dsDNA:double stranded DNA; ssDNA:single stranded DNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.

图3 RT-qPCR和Southern blot法检测在HepG2.2.15和HepAD38细胞系中过表达HSP70对HBV复制中间体的影响

Figure 4.The effect of HSP70 overexpression in HepG2.2.15 and HepAD38 cells on HBV 3.5 kb mRNA levels was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.

图4 RT-qPCR检测在HepG2.2.15和HepAD38细胞系中过表达HSP70对HBV 3.5 kb mRNA的影响

3 过表达HSP70对HBV启动子活性的影响

为了进一步分析HSP70影响HBV复制的分子机制，我们在HepG2.2.15和HepAD38细胞中利用双萤光素酶报告系统分析过表达HSP70对HBV启动子活性的影响，结果显示，过表达HSP70抑制了HBV核心启动Cp的活性，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。因此，以上数据提示HSP70可能通过抑制核心启动子Cp的活性抑制HBV的复制。

Figure 5.The effect of HSP70 overexpression in HepG2.2.15 and HepAD38 cells on HBc expression was detected by Western blot.

图5 Western blot法检测在HepG2.2.15和HepAD38细胞系中过表达HSP70对核心蛋白的影响

讨 论

热休克蛋白在保护细胞免受应激所致的潜在致死效应中具有重要作用[6-7]，其功能涉及细胞增殖与凋亡、多重耐药以及P53功能的调节等[14]。根据蛋白质组学分析，HSP70在HBV相关的肝细胞癌发展中发挥了重要作用[15]；有研究报道，HSP70通过阻止核蛋白复合体的核转位从而抑制甲型流感病毒复制[16]；这提示HSP70在病毒复制调控中发挥了重要作用，因此我们探究了HSP70在调节HBV复制中的作用。本研究中，我们发现HSP70在HBV表达细胞系中显著下调，过表达HSP70可以显著抑制HBV复制中间体、3.5 kb mRNA以及核心蛋白的表达。这些结果表明HSP70与HBV的复制密切相关。

Figure 6.Effects of HSP70 overexpression on HBV promoter activity in Hep2.2.15 and HepAD38 were detected by dual luciferase Reporter System. Mean±SD.n= 3.*P<0.05vsvector group.

图6 双萤光素酶报告系统检测在Hep2.2.15 和HepAD38细胞中过表达HSP70对HBV启动子活性的影响

之前的研究发现有许多宿主因子参与HBV复制生命周期。HSP(gp96)通过HBx诱导NF-κB激活从而增强HBV的复制[17]；锌指蛋白是一种固有的宿主抗病毒因子，在转录后下调pgRNA从而抑制HBV复制[18]，另外有研究报道,HS3ST3B1通过下调HBV启动子元件活性从而抑制HBV基因表达和DNA复制[19]；综上所述，我们推测HSP70可能通过影响HBV基因启动子活性来调节HBV转录和复制。我们在HepG2.2.15和HepAD38细胞中过表达HSP70后发现，HBV核心启动子Cp的活性明显下降，与前面结果一致的是，3.5kb mRNA、核心蛋白的转录表达正是由核心启动子Cp调控的。有文献报道，SIRT1通过激活转录因子AP-1与核心启动子的结合，从而促进HBV的复制[20]；另外，ZEB2可直接结合到HBV核心启动子上并抑制启动子的活性，从而抑制HBV的转录与复制[21]。因此，我们猜想HSP70可能是通过直接或间接作用于HBV核心启动子而影响HBV复制与转录的。

综上所述，本研究结果提示HSP70在HBV复制过程中起抑制作用，对乙型肝炎治疗方法的发展具有重要意义。然而，HSP70介导的HBV复制调控的详细机制还需要进一步研究。

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(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

Effect of HSP70 on HBV replication

ZHOU Hong-zhong, LIU Bo, REN Ji-hua, TAO Na-na, CHEN Xiang, LI Wan-yu, CHEN Juan

(KeyLaboratoryofMolecularBiologyonInfectiousDiseasesofMinistryofEducation,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:yixin_xinyuan@163.com)

AIM: To investigate the role of heat shock protein 70(HSP70)in hepatitis B virus (HBV) replication. METHODS: The effect of HBV replication on the expression of HSP70 was analyzed by RT-qPCR. The overexpression efficiency of HSP70 was confirmed by Western blot. The effect of HSP70 overexpression on HBV DNA replicative intermediates was analyzed by RT-qPCR and Southern blot. The effects of HSP70 overexpression on the expression level of HBV 3.5 kb mRNA and HBV core protein were measured by RT-qPCR and Western blot, respectively. The Effect of HSP70 overexpression on HBV promoter activity was detected by dual luciferase reporter system. RESULTS: The mRNA levels of HSP70 were inhibited by HBV replication. Overexpression of HSP70 repressed the expression of HBV DNA replicative intermediates, 3.5 kb mRNA and core protein, as well as HBV core promoter activity. CONCLUSION: HBV replication inhibits the expression of HSP70. Overexpression of HSP70 represses HBV replication. These data suggest that HSP70 repressed HBV replication by inhibiting HBV core promoter activity.

Heat shock protein 70; HBV

1000- 4718(2016)08- 1425- 05

2016- 03- 10

2016- 06- 27

国家自然科学基金资助项目(No. 81472271)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.014

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 023-68486780；E-mail: yixin_xinyuan@163.com