分化型甲状腺癌患者术后血清微小RNA-21含量评判预后的临床价值

曹礼荣，王玉云，邱　涵，王　薇

(1. 湖北中医药高等专科学校，湖北 荆州 434020；2. 华中科技大学附属荆州市中心医院，湖北 荆州 434020)



分化型甲状腺癌患者术后血清微小RNA-21含量评判预后的临床价值

曹礼荣1，王玉云1，邱涵2，王薇2

(1. 湖北中医药高等专科学校，湖北 荆州 434020；2. 华中科技大学附属荆州市中心医院，湖北 荆州 434020)

[摘要]目的探讨血清微小RNA-21(miRNA-21)含量评估分化型甲状腺癌(DTC) 术后患者复发/转移、识别高危风险患者的临床价值。方法收集DTC患者及良性甲状腺结节患者(作为良性结节组)的一般情况、个人史、家族遗传史、职业暴露史、相关既往史等基本情况，并测定血清促甲状腺激素(TSH)、癌胚抗原(CEA)、降钙素(CT)、抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)、甲状腺球蛋白抗体(TG-Ab)、甲状腺球蛋白(TG)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)、细胞角蛋白多肽-19(CK-19)及miRNA-21含量。所有DTC患者均术后常规随访2年，依据随访是否出现不良预后事件分为健康组及不良预后组。比较3组患者上述观察指标的差异性，使用多因素Logistic回归分析得出影响结局的独立危险因素，使用皮尔逊积矩相关系数(PPMCC)分析miRNA-21与其他独立危险因素是否具有相关性，通过受试者工作特征曲线(ROC curve)评估该指标对于DTC患者不良预后的预测价值及临界值；根据其预测临界值，将DTC患者分为临界值以上组及以下组，使用卡普兰-迈耶曲线(KM curve)验证2组患者不良预后发生率是否具有差异性，从而识别高危风险的DTC患者。结果健康组51例、不良预后组10例、良性结节组57例，3组间HT病史、GD病史、职业暴露史、家族遗传史及血清TPO-Ab、TG-Ab、TG、CT、CEA、CK-19、miRNA-21水平比较差异均有统计学意义(P均<0.05)；多因素Logistic回归显示TPO-Ab、TG-Ab、CT、CK-19、miRNA-21是DTC患者术后2年内发生不良预后事件的独立危险因素；其中miRNA-21与TPO-Ab、CT、CK-19均呈正相关(r=0.538, 0.604，0.522，P均<0.05)，与TG-Ab无显著相关性(r=0.371, P>0.05)；该指标ROC曲线的AUC为0.748，95%CI(0.707，0.814)，最佳预测值为8.19 ng/mL；根据miRNA-21的最佳预测值，临界值以上的DTC术后患者2年内并发不良预后事件的比率明显增高(P<0.05)， KM生存曲线亦证实上述研究结果。结论血清miRNA-21含量对于评估DTC术后复发/转移情况、识别高危风险DTC患者具有重要意义。

[关键词]分化型甲状腺癌；微小RNA；不良预后

甲状腺癌是近20多年发病率增长最快的恶性实体肿瘤，据美国相关流行病学调查资料显示，近年来总体发病率平均增长6.2%[1]，已成为当前内分泌系统、头颈部最为常见的恶性肿瘤。其中约90%的甲状腺癌为分化型甲状腺癌(DTC)，其由乳头状癌及滤泡状癌构成，前者发病率逾越70%，后者发病率约为15%[2-3]。两类DTC患者发病年龄普遍较轻，起病早期多无明显自觉症状，病情进展缓慢，由于该病恶性程度相对较低，因而外科治疗后的预后相对较好[3]。但不容忽视的是，DTC具有术后易于复发的特点，且随着超声影像技术的进步，相关检出率不断提升，10%～20%的DTC患者术后5年内出现不同程度的复发及转移，显著影响患者预后[4]。因而对于手术后的DTC患者进行有效危险分层，从而及时干预高危预后的患者，可有效降低肿瘤转移及复发的发生概率[5]，改善预后，亦能有效节约医疗资源。但是，当前临床对于术后DTC是否复发/转移的预判识别主要依赖于相关血清肿瘤标志物的检查，受患者年龄、性别、机体内分泌情况[6]、术中肿瘤组织侵犯情况[7]、术后是否接受放射性核素治疗[8]等多重因素干扰，相关标志物对于早期评判DTC患者是否复发/转移并进行精确危险分层的价值差强人意。基于上述临床背景，近年来微小RNA(miRNA)与甲状腺肿瘤之间存在的关联逐渐得到学术界重视。miRNA为非编码的单链小RNA分子，由18-27核苷酸组成，属于短链非编码RNA[9]。miRNA作为潜在癌基因及抑癌基因，通过转录后调控机制抑制靶基因表达，从而可用于癌症的诊断[10]。其中miRNA-21被认为是miRNA转录的主要驱动因子，通过调控PDCD4、PTEN、SMARCA4、TPMl、TIMP3、ANP32A等位点，在多种实体肿瘤中呈现高表达，广泛参与肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡。但由于既往文献并未就血清miRNA-21含量与DTC患者不良预后的相关性进行研究，且缺乏该指标是否可以评判DTC预后转归的依据，因此笔者拟设计长周期临床研究进行探讨，从而为下阶段的大样本、多中心研究提供理论依据。

1临床资料

1.1研究对象选择荆州市中心医院2012年7月1日—2013年7月1日连续收治的DTC和良性甲状腺结节患者，均于术中行快速冰冻切片以明确病情，DTC患者均接受甲状腺癌根治术，且术后1个月完成放射性131I清除残留甲状腺治疗。上述诊疗过程均符合《甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南(2012版)》[11]。排除既往有颈部手术且对局部解剖结构产生明显影响者；颈部最大结节直径≥4 cm的占位性病变者；甲状腺癌已并发远端转移者；术中见肿瘤浸润淋巴结或血管者；严重的凝血功能异常者；术中无法全部切除肿瘤组织者；年龄≥65岁者；术后全身131I显像发现有异常放射性摄取者。剔除后续随访过程中出现伴发难以控制的全身性感染者，因其他疾病需要大剂量糖皮质激素治疗者，新发其他恶性肿瘤者，严重创伤、多发伤、复合伤者。本次研究符合赫尔辛基宣言及中国临床试验研究的相关法规，所有受试患者入选前均已签署知情同意书或授权家属签署，所有患者获取知情同意书的过程亦符合临床试验研究的质量管理规范要求。

1.2研究方法收集所有入选者的个人史(抽烟或碘摄入异常或激素依赖)、家族遗传史、职业暴露史(电离或辐射)等基本情况，了解既往是否合并有桥本甲状腺炎(HT)、毒性弥漫性甲状腺肿(GD)等相关疾病，记录术中颈部最大结节的直径。并于清甲完成后1周内，清晨空腹状态下，抽取静脉血液标本(良性甲状腺结节患者相关资料取术前检查结果)，采用免疫化学发光法测定促甲状腺激素(TSH)、癌胚抗原(CEA)、降钙素(CT)含量，试剂盒由武汉市博士德生物公司提供；使用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)、甲状腺球蛋白抗体(TG-Ab)、甲状腺球蛋白(TG)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)含量，试剂盒购自美国Phoenix Pharmaceutical公司；采用电化学发光法测定细胞角蛋白多肽-19(CK-19)含量，试剂盒为相应配套试剂盒；使用ABI7500荧光定量PCR仪测定miRNA-21含量，根据miRNA cDNA首链合成试剂盒说明书提取RNA进行逆转录，最终数据用2-△△ct法进行分析。实验所需的miRNA提取试剂盒、cDNA首链合成试剂盒、miRNA荧光定量试剂盒均购自美国Applied Biosystems公司。于2014年7月1日—2015年7月1日，电话通知患者前来复查以完成术后随访。所有患者的随访时间均不少于2年，随访终点事件为DTC患者术后是否发生不良预后转归事件(复发/转移)。按照随访结果将DTC患者分为健康组及不良预后组，将良性甲状腺结节患者作为良性结节组，比较3组相关统计指标的差异性；使用多因素Logistic回归分析校正上述组间相关指标资料，以得出影响结局的独立危险因素；使用皮尔逊积矩相关系数(PPMCC)分析上述独立危险因素指标与miRNA-21是否具有相关性；进一步使用受试者工作特征曲线(ROC curve)评估miRNA-21是否具备预测DTC患者发生不良预后的检验效能，计算出最佳预测临界值及其敏感性及特异度；如miRNA-21可用于预测DTC患者的预后转归，则根据最佳预测临界值，将DTC患者分为临界值以上组及以下组，使用卡普兰-迈耶曲线(KM curve)观察2组患者的不良预后发生率，以进一步验证其中是否存在差异性，从而早期识别术后高危风险的DTC患者。

2结果

2.1纳入患者情况共纳入61例DTC患者，男19例，女42例；年龄(40.37±9.12)岁。累计6例患者失访，其中3例患者更换手机号码失联、2例患者迁至外地、1例患者因股骨头置换术入院无法配合随访，总体失访率为9.83%。最终55例患者完成随访，其中健康组47例,不良预后组8例。纳入良性甲状腺结节患者57例。

2.2健康组、不良预后组及良性结节组各观察指标比较3组间HT病史、GD病史、职业暴露史、家族遗传史及血清TPO-Ab、TG-Ab、TG、CT、CEA、CK-19、miRNA-21水平比较差异均有统计学意义(P均<0.05)，其余指标比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

2.3影响DTC不良预后的独立危险因素使用多因素Logistic回归模型进一步校正上述组间比较差异有统计学意义的指标，结果显示TPO-Ab、TG-Ab、CT、CK-19、miRNA-21是DTC患者术后2年内发生不良预后事件的独立危险因素(P均<0.05)。见表2。

2.4miRNA-21与其他具有差异性指标相关性分析PPMCC检验验证显示：miRNA-21与TPO-Ab、CT、CK-19均呈正相关(r=0.538,0.604，0.522，P均<0.05)，与TG-Ab无显著相关性(r=0.371,P>0.05)。

表1　2组DTC患者术后组间资料的比较

表2　DTC患者相关危险因素多因素Logistic回归分析结果

2.5miRNA-21预测DTC患者不良预后的价值以灵敏度为纵坐标、以误诊率(1-特异度)为横坐标，绘制ROC曲线以评判miRNA-21作为独立危险因素对于DTC患者术后2年内出现不良预后事件的预测价值：ROC曲线的AUC为0.748，95%CI(0.707，0.814)；miRNA-21最佳预测临界点的灵敏度为60.27%，特异度为73.69%；miRNA-21最佳预测值为8.19 ng/mL。见图1。

图1　miRNA-21预测DTC患者术后2年内

2.6验证miRNA-21对于高危DTC患者的判断价值根据miRNA-21的最佳预测值，将所有DTC患者再分为临界值以上组(n=11)及临界值以下组(n=44)。根据随访结果，发现临界值以上组患者2年内并发不良预后事件的比率为63.63%(7/11)，临界值以下组患者2年内并发不良预后事件的比率为2.27%(1/44)，即miRNA-21≥8.19 ng/mL时，DTC术后患者于2年内并发不良预后事件的比率明显增高(2=17.106,P<0.05)。绘制KM曲线，亦可见临界值以下组的不良预后发生率较临界值以下组明显降低。见图2。

图2　不同miRNA-21临界值组DTC患者术后2年内

3讨论

肿瘤的发生、发展机制非常复杂，涉及多种癌基因、抑癌基因和信号转导通路的改变。miRNA通过细胞早期发育、增殖、分化、凋亡、代谢等途径，广泛参与生命活动中的系列进程。miRNA-21是一种具有癌基因特性的促癌miRNA，其基因位于染色体17q23.2，在许多肿瘤中都存在异常表达，可作为肿瘤发生、发展过程中的重要调控因素[12]。Chang等[13]首次发现miRNA-21在人类恶性胶质瘤中呈现高表达，并通过抑制细胞凋亡促进肿瘤的发生；张建龙等[14]研究证实，miRNA-21是结肠癌中表达上调最常见的miRNA；Lawrie等[15]通过临床试验发现，B细胞淋巴瘤患者血清miRNA-21含量明显高于健康人，且增高程度与复发率和生存率密切相关。

本研究发现miRNA-21是DTC术后并发不良事件的敏感指标；通过多因素Logistics回归分析进一步排除其他因素干扰、校正各项危险因素对于结局的影响，发现miRNA-21与TPO-Ab、TG-Ab、CT、CK-19均为DTC术后患者不良预后的独立危险因素。笔者查阅相关指南发现，CT对于评判DTC患者是否具有淋巴管或远处转移风险具有相当好的同步性，术前若CT>100 ng/L，则远处转移的概率较高，术后CT水平仍高于正常水平的患者多有肿瘤残存，易于复发；此外，检测TG-Ab对判断DTC复发或残留的敏感性与特异性最高，该指标是提示肿瘤持续存在的高度敏感指标[16]。本研究使用PPMCC验证miRNA-21含量与其他危险因素含量的相关性，发现miRNA-21与TPO-Ab、CT、CK-19均呈显著正相关，表明miRNA-21含量用于评判DTC患者术后复发/转移具有一定的临床价值。再以miRNA-21作为独立危险因素绘制ROC曲线，用于评判该指标对于DTC术后患者不良预后的预测效能，发现该ROC曲线的AUC为0.748，说明miRNA-21用于评判预后具有较高的预测价值，其预测临界值为8.19 ng/mL；进一步分组比对发现，高于临界值的DTC术后患者，其不良预后转归发生率远远高于低于临界值的DTC术后患者；结合KM曲线结果充分验证了miRNA-21含量对于DTC术后患者不良预后的预测价值，即高于此临界值的DTC术后患者具有更高的不良预后风险。

限于本次研究的周期较短，纳入样本的数量偏少，研究结果难免存在局限性；且本研究为单中心研究，并未就不同手术者、不同药物干预对于具体指标的动态波动进行监测，但通过本研究可以得出以下结论：①血清miRNA-21含量是对DTC术后不良预后诊断体系的有效补充；②血清miRNA-21含量可用于评估DTC患者的预后转归；③8.19 ng/mL为血清miRNA-21预测DTC不良预后的临界值，高于该临界值的DTC患者具有更高的不良预后风险。

综上所述，血清miRNA-21含量对于评估DTC术后复发/转移情况、识别高危风险DTC患者具有重要意义，具备广阔的应用前景，但该指标的应用时间尚短，相关实验研究和临床应用还需进一步深化，以期更好的指导临床应用。

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Clinical value of miRNA-21 level on prognosis evaluation for patients with differentiated thyroid cancer after surgery

CAO Lirong1, WANG Yuyun1, QIU Han2, WANG Wei2

(1. Hubei College of Chinese Medicine, Jingzhou 434020, Hubei, China; 2. The Affiliated Jingzhou Central Hospital of Huazhong University of Science and Technology, Jingzhou 434020, Hubei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the clinical value of miRNA-21 level on the evaluation for recurrence and metastasis of differentiated thyroid carcinoma (DTC) and the recognition of the high risk patients. Methods The basic information of DTC patients and benign thyroid nodules patients include general situation, personal history, family history, occupational exposure, related past history were collected, and the levels of thyroid stimulation hormone (TSH), carcinoembryonic antigen (CEA), calcitonin (CT), anti-thyroid peroxidase antibodies (TPO-Ab), thyroglobulin antibodies (TG-Ab), thyroglobulin (TG), three free triiodothyronine (FT3), free four triiodothyronine (FT4), cytokeratin polypeptides-19 (CK-19) and miRNA-21 were detected in all patients. All DTC patients were divided into health group and poor prognosis group according to the results of follow-up for 2 years. The data were compared among the three groups. The independent risk factors of affect the outcome were analyzed by multivariate logistic regression analysis; the correlation of miRNA-21 and other independent risk factors were analyzed by Pearson product moment correlation coefficient (PPMCC) analysis; the predictive value and critical value of these indexes on poor prognosis of DTC patients were evaluated by the receiver operating characteristic (ROC) curve; and based on its prediction of critical value, the evaluation value on the incidence of poor prognosis were verified by the Kaplan-Meier (KM) curve. Results There was 51 cases in healthy group, 10 cases in poor prognostic group and 57 cases in thyroid nodules group. There were significant differences among the three groups in HT history, GD history, occupational exposure history, family history, and the levels of TPO-Ab, TG-Ab, TG, CT, CEA, CK-19, miRNA-21 (all P<0.05). Multivariate Logistic regression analysis showed that the levels of TPO-Ab, TG-Ab, CT, CK-19 and miRNA-21 was an independent risk factor for poor prognosis in patients with DTC events after 2 years; which, miRNA -21 was positively correlated with TPO-Ab (r=0.538, P<0.05), and CT (r=0.604, P<0.05), and CK-19 (r=0.522, P<0.05); but no correlated with TG-Ab (r=0.371, P>0.05). The AUC of ROC curve was 0.748, 95%CI(0.707, 0.814), the best predictive value was 8.19 ng/mL; accordance with the best predictive value of miRNA-21, the concurrent poor prognosis events ratio of 2 years in DTC patients above the threshold was significantly higher (P<0.05), KM survival curves also confirm these findings. ConclusionSerum miRNA-21 levels has an important significance on the evaluation for recurrence and metastasis of differentiated thyroid carcinoma (DTC) and the recognition of the high risk patients.

Key words:differentiated thyroid carcinoma; micro RNA; poor prognosis

[收稿日期]2015-11-10

[中图分类号]R736.1

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)12-1264-05

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.12.004

[作者简介]曹礼荣，男，主治医师，讲师，主要研究方向为甲乳外科疾病。[通信作者]王玉云，E-mail：dagou_001@163.com