买朱尼对骨性关节炎大鼠关节软骨中Wnt/β-catenin信号通路的调控作用研究

刘振峰，刘新梅，方　锐，艾力江·阿斯拉，邓迎杰，宋玉成

(新疆维吾尔自治区中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000)



买朱尼对骨性关节炎大鼠关节软骨中Wnt/β-catenin信号通路的调控作用研究

刘振峰，刘新梅，方锐，艾力江·阿斯拉，邓迎杰，宋玉成

(新疆维吾尔自治区中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000)

[摘要]目的观察维药买朱尼对骨性关节炎模型大鼠关节软骨中Wnt/β-catenin信号通路的调控作用，探讨买朱尼对软骨细胞的保护作用机制。方法将30只SD大鼠随机分为假手术组、模型组和买朱尼组，每组10只。模型组和买朱尼组采用改良Hulth造模法建立膝骨关节炎模型，建模第2周开始买朱尼组灌胃买朱尼10.31 mg/(kg·d)，模型组和假手术组灌胃等量生理盐水，均连续4周。末次灌胃后24 h取3组大鼠膝关节软骨标本进行大体评分和组织学评分，采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测Wnt/β-catenin通路中β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a的表达水平。结果模型组大鼠膝关节软骨标本大体评分、软骨组织学Mankin评分及软骨细胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt-3a蛋白及mRNA表达水平均明显高于假手术组(P均<0.05)，而买朱尼组均明显低于模型组(P均<0.05)。结论维药买朱尼可以减轻大鼠膝关节软骨退变的程度，其可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路来发挥保护关节软骨细胞的作用。

[关键词]骨性关节炎；维药买朱尼；Wnt/β-catenin通路

骨性关节炎是一种多发于老年人的慢性骨关节疾病，以关节软骨渐进性和退行性病变为主要特征，严重影响患者下肢运动功能及生活质量[1]。目前研究发现，骨性关节炎的发病机制较为复杂，涉及多条信号通路，其中Wnt/β-catenin通路在骨性关节炎发病过程中发挥着重要作用[2]。Wnt信号通路在多种生理/病理过程中发挥作用，包括生物体的生长、发育、疾病、衰老等，也包括细胞增殖、分化、凋亡、应激、免疫等[3-5]。维药买朱尼是二级干热蜜膏制剂，具有补益脑肾、缓解疼痛、活血、燥湿等作用，适用于外来寒邪因素引发的非体液型寒性气质失调疾病。买朱尼中主要成分西红花有强健筋骨、醒神益智、暖体通阻的功效，对膝关节骨性关节炎有显著的治疗效果[6]。本实验通过构建骨性关节炎大鼠模型，研究了维药买朱尼对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用，旨在从分子水平探讨买朱尼对软骨细胞的保护作用机制。

1实验资料

1.1药物维药买朱尼成分包括巴旦杏仁、阿月浑子、肉豆蔻、胡椒、姜/桂皮、坷子皮、毛坷子、余甘子、欧白芨各15 g，蜂蜜2倍量，由新疆维吾尔自治区中医院提供。

1.2实验动物雄性健康清洁级SD大鼠30只，鼠龄2个月，体质量(250±10)g，由新疆医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(新)2013-0032。复合饲料喂养，饲养温度为20～25 ℃，湿度为60%。实验过程中对动物处置符合动物实验伦理学要求。

1.3实验方法

1.3.1动物分组、模型构建及药物处理将30只大鼠随机分为假手术组、模型组和买朱尼组，每组10只。采用改良Hulth造模法[7]建立大鼠膝关节骨性关节炎模型：将大鼠麻醉后仰卧固定于手术台上，无菌条件下取膝关节内侧纵切口长约2 cm，显露膝关节，然后切断前后交叉韧带及内侧副韧带，完整切除内侧半月板，保留关节软骨面。术后不固定伤肢，自由活动，可适当给予抗生素预防感染。手术7 d后驱赶动物，每日30 min，分2次驱赶，驱赶4周后即得明显的骨性关节炎模型。买朱尼组从建模第2周开始灌胃买朱尼，根据人鼠体质量换算出服药量为10.31 mg/(kg·d)[8]，假手术组和模型组均灌胃等量生理盐水，均持续4周。

1.3.2标本大体观察末次灌胃后24 h采用CO2安乐死法处死大鼠[9]，观察大鼠膝关节软骨并根据文献[10]标准进行评分：0分，关节面光滑；1分，关节面粗糙；2分，关节面糜烂；3分，关节面溃疡；4分，软骨剥脱。

1.3.3软骨组织学评分固定股骨内侧髁，放入硝酸进行脱钙，用刀片取软骨组织，并经乙醇、二甲苯脱水至透明，石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红染色。显微镜下观察并对标本进行改良Mankin评分[11]。

1.3.4软骨细胞β-catenin、GSK-3β、Wnt-3a mRNA表达检测将大鼠软骨组织加入1 mL TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)，抽提细胞总RNA，反转录为cDNA，反应条件：2 μg RNA,1 μL 0.5 μg/μL Oligo(dT)Primer (Promega Corp),1 μL 10 mmol/L dNTP Mix,5 μL M-MLV 5X Reaction Buffer和1 μL 200 IU/μL M-MLV反转录酶(终体积25 μL)。使用Primer 5.0软件设计引物，Wnt-3a上游引物：5’-AGACTATCTCTGTCATG-3’，下游引物：5’-GCCCCGTATAGGCATTCGA-3’；β-catenin上游引物：5’ ACCATTCGGCTAAACGGTC，下游引物：5’- CAGGCCATTTACGATTACA-3’；GSK-3β-5上游引物：5’- GCTATGAATTCGATCGAGT-3’，下游引物：5’-CAGGGCTTAGGCAGTGAA-3’；GAPDH上游引物：5’-TGCTGAGTATGTTTCTTGCC-3’，下游引物：5’-GTCTTCTGAGTGGGCAT-3’。Real time PCR扩增条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环。

1.3.5软骨细胞β-catenin、GSK-3β、Wnt-3a 蛋白表达检测采用Western blot 法检测。 剥离大鼠软骨组织，抽提细胞总蛋白，BCA方法进行蛋白浓度鉴定。各取20 μL样品(含10 μg总蛋白)进行SDS-PAGE，并转移至硝酸纤维素膜上，与封闭液室温孵育2 h后分别与兔抗鼠β-catenin、Wnt-3a、GSK-3β、GAPDH单克隆抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，羊抗兔多克隆二抗IgG(1∶5 000)37 ℃孵育1 h。用Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR Biosciences，NE，USA)检测蛋白信号，采用软件Odyssey system application进行蛋白表达定量分析，GAPDH作为内参。所有使用抗体均购自美国Santa cruz公司。

1.4统计学方法数据采用SPSS 15.0统计软件包进行统计学处理，用均数±标准差表示，大体评分采用秩和检验，其余检测采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠膝关节软骨标本大体评分情况模型组大鼠膝关节软骨标本大体评分明显高于假手术组(P<0.05)，买朱尼组大鼠软骨标本大体评分明显低于模型组(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠膝关节软骨标本大体评分情况　　只

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.2各组大鼠膝关节软骨组织学评分假手术组改良Mankin评分为(0.56±0.35)分，模型组为(2.86±1.27)分，买朱尼组为(1.37±1.01)分。模型组改良Mankin评分明显高于假手术组(P<0.05)，买朱尼组明显低于模型组(P<0.05)。

2.3各组大鼠膝关节软骨细胞β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a mRNA表达水平模型组中软骨细胞β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a mRNA表达水平均明显高于假手术组(P均<0.05)，买朱尼组β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a mRNA表达水平均明显低于模型组(P均<0.05)。见表2。

表2　各组大鼠膝关节软骨细胞β-catenin、GSK-3β和

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.4各组大鼠膝关节软骨细胞β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a蛋白表达水平模型组中软骨细胞β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a蛋白表达水平均明显高于假手术组(P均<0.05)，买朱尼组β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a蛋白表达水平均明显低于模型组(P均<0.05)。见图1及表3。

3讨论

骨性关节炎是一种退行性病变，表现为关节软骨变性、丢失、纤维化、溃疡及骨赘形成，可以继发于畸形性关节炎、创伤性关节炎等影响关节软骨或造成关节负重不平衡的骨关节疾病，目前其发病机制尚不清楚。在全球逐步进入老龄化社会的背景下，骨性关节炎因其患病率高、危害性大，已成为备受关注的、十分严重的公共健康问题。近年来有学者发现，Wnt信号通路对细胞增殖、分化、凋亡、衰老等具有调节作用，并参与骨代谢相关疾病的发病过程[12-14]。为证明Wnt信号在软骨细胞基质分解代谢中的作用，Yuasa等[15]采用Wnt-3a刺激兔关节软骨细胞，发现金属蛋白酶3和金属蛋白酶13的表达增强，并且促进了IL-1β引起的蛋白多糖基质丢失。Blom等[16]发现骨性关节炎大鼠模型关节软骨细胞中Wnt-16和Wnt2β的表达水平显著上升，并进一步诱导关节组织中MMPs和聚蛋白多糖酶的表达，从而导致关节软骨的损伤。Wnt通路中关键分子包括β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a，其中β-catenin是Wnt/β-catenin通路的核心分子，上游分子传递的信号均需通过β-catenin才能发挥作用。Corr[17]在退变的软骨细胞内观察到β-catenin表达显著增加，从而推断Wnt信号通路的激活与软骨丢失有关。Johlrson等[18]研究发现，β-catenin在骨性关节炎患者的关节软骨组织中表达明显上升，其过度表达在骨性关节炎形成中起重要作用。GSK-3β是轴蛋白(Axin)的关键组成部分，通过磷酸化β-catenin 使细胞质内β-catenin维持低水平[19]。

图1　各组大鼠关节软骨细胞β-catenin、

组别nβ-cateninGSK-3βWnt-3a假手术组101.051±0.2351.003±0.4850.969±0.236模型组103.792±0.861①2.692±1.035①2.681±1.264①买朱尼组101.458±0.658②1.364±0.482②1.956±0.529②

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

近年来许多学者开展了中药复方及提取物对Wnt信号通路干预的相关研究，并取得了一些进展。二级干热蜜膏制剂买朱尼具有缓解疼痛、开通阻滞、强筋健骨、燥湿、活血等功效，其可以调节IL-1β诱导的大鼠关节软骨细胞基质金属蛋白酶1/13及其组织抑制因子Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达，对骨性关节炎有潜在的治疗价值[20-21]。本研究进一步发现，维药买朱尼可以显著降低软骨大体评分及 Mankin评分，降低软骨细胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt-3a的mRNA和蛋白表达水平。提示买朱尼可以减轻大鼠膝关节软骨退变的程度，其可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路来发挥保护关节软骨细胞的作用。

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Effects of Uygur medicine Maizhuni on Wnt/β-catenin pathway in rat osteoarthritis models

LIU Zhenfeng, LIU Xinmei, FANG Rui, AI Lijiang·Asila, DENG Yingjie, SONG Yucheng

(Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumchi 830000, Xinjiang, China)

Abstract:Objective It is to study the regulatory function of Uygur medicine Maizhuni on Wnt/β-catenin pathway in rat osteoarthritis models. Methods Knee osteoarthritis model was constructed using modified Hulth method. 30 healthy SD rats were randomly divided into sham group, model group and Maizhuni group with 10 rats in each group. From the second week, rats were administered with Uygur medicine Maizhuni (10.31 mg/(kg·d)) or saline by gavage for 4 weeks. General scores and Mankin scores of rat knee joint cartilage in the three groups were evaluated. Quantitative real-time PCR and Western blotting were used to determine the expression of β-catenin, GSK-3β and Wnt-3a in the Wnt/β-catenin pathway. Results Compared to the sham group, the general scores and Mankin scores of rat knee joint cartilage degeneration in Maizhuni group was significantly increased. Compared to the model group, the degree of rat knee joint cartilage degeneration in Maizhuni group was obviously alleviated. The cartilage general score and Mankin score in Maizhuni group was lower than that in the model group (P<0.05). On the molecular lever, we found that Maizhuni treatment significantly reduced the expression of β-catenin, GSK-3β and Wnt-3 in the knee joint chondrocytes (P<0.05). Conclusion Uygur medicine Maizhuni could protect the articular cartilage by regulation of Wnt/β-catenin pathway.

Keywords:osteoarthritis, Uygur medicine Maizhuni, Wnt/β-catenin pathway

[收稿日期]2015-07-01

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)07-0690-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.07.002

[基金项目]新疆维吾尔自治区青年科技创新人才培养工程(2013721040)

[作者简介]刘振峰，男，硕士，主治医师，助理研究员，主要从事骨代谢性疾病的研究。[通信作者]方锐，E-mail：85681924@qq.com