斑节对虾UBE2H基因克隆及其表达

唐蕾 傅明骏 刘文生 黄建华 周发林 江世贵

摘要：【目的】克隆斑節对虾（Penaeus monodon）泛素结合酶E2 H基因（UBE2H），了解其组织特异性表达情况，为揭示UBE2H在斑节对虾卵巢发育过程的作用提供依据。【方法】PCR扩增斑节对虾UBE2H基因的开放阅读框，利用实时荧光定量PCR检测UBE2H基因在斑节对虾各组织及不同发育期斑节对虾肝胰腺和卵巢中的表达情况；并构建pET32a-UBE2H原核表达重组质粒，进行诱导表达及蛋白纯化。【结果】克隆获得的斑节对虾UBE2H基因全长1010 bp（GenBank登录号KU870456），其中，5'非编码区77 bp，3'非编码区378 bp，开放阅读框555 bp（编码184个氨基酸）。斑节对虾UBE2H蛋白等电点（pI）4.88，分子量20.85 kD。斑节对虾UBE2H氨基酸序列与其他物种相似度很高，为78.00%～83.00%。实时荧光定量PCR检测结果显示，UBE2H基因在斑节对虾淋巴组织中表达量最高，其次为鳃；在斑节对虾不同卵巢发育期肝胰腺和卵巢中的表达量均呈先上升后下降的变化趋势，但其峰值出现时间存在差异，肝胰腺的最高表达量出现在卵巢III期，卵巢的最高表达量出现在卵巢II期。经原核表达获得的斑节对虾UBE2H融合蛋白约39.00 kD，纯化后的蛋白浓度为2.92 μg/μL。【结论】斑节对虾UBE2H参与了其卵母细胞发育和肝胰腺中卵黄蛋白的转运过程，与斑节对虾的卵巢发育密切相关。

关键词： 斑节对虾；UBE2H基因；克隆；实时荧光定量PCR；原核表达

中图分类号： S945.47 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）11-1958-08

Abstract：【Objective】The present study was conducted to clone ubiquitin-conjugating enzyme E2 H gene（UBE2H） of Penaeus monodon and explore its tissue specific expression， in order to provide references for revealing ovary development of P. monodon. 【Method】Open reading frame of UBE2H gene in P. monodon was amplified by PCR， and UBE2H gene expressions in different tissues， and in hepatopancreas and ovary of P. monodon at different ovary developmental stages were detected using real-time quantitative PCR. pET32a-UBE2H prokaryotic expression recombinant plasmid was constructed， and induction expression and protein purification was carried out. 【Result】The cloned UBE2H gene（GenBank accession No. KU870456） was 1010 bp in length， including 5'UTR of 77 bp and 3'UTR of 378 bp and an open reading frame（ORF） of 555 bp（encoding 184 amino acids）. Isoelectric point（pI） of UBE2H protein was 4.88， molecular weight was 20.85 kD. Amino acid sequence of UBE2H protein was highly similar to those of other species， the similarity reached 78.00%-83.00%. Real-time quantitative PCR results indicated that expression quantity of UBE2H gene was the highest in lymphoid tissue in P. monodon， and followed by gill. The expression quantities of UBE2H gene in hepatopancreas and ovary at different ovary developmental stages both went through an up-down variation， but peak times were different. The largest expression quantity of UBE2H gene in hepatopancreas occurred at ovary developmental stage Ⅲ， whereas the largest expression quantity in ovary occurred at ovary developmental stageⅡ. Fusion protein UBE2H obtained through prokaryotic expression was 39.00 kD， protein concentration after purification was 2.92 μg/μL. 【Conclusion】UBE2H gene of P. monodon participate in oocyte development and transport of yolk protein in hepatopancreas， and is closely related to ovary development of P. monodon.

Key words： Penaeus monodon； UBE2H gene； clone； real-time quantitative PCR； prokaryotic expression

0 引言

【研究意義】泛素结合酶E2 H（Ubiquitin-conjuga-

ting enzyme E2 H，UBE2H）属于泛素结合酶E2家族成员，其主要功能是在E1激活泛素后协助特异性E3s将活化的泛素转移到底物上，从而使底物转移到蛋白酶体上进行降解（邱小波等，2008；张莹莹等，2008b）。已有研究证实，UBE2H的主要作用蛋白为组蛋白和细胞骨架蛋白，同时参与运动神经元的退行性途径（Martin et al.，2009）。斑节对虾（Penaeus monodon）是世界三大养殖对虾品种之一，具有较高的经济价值，发展至今其人工繁殖技术已逐渐完善，但有关卵巢发育的分子机制尚未明确。因此，研究UBE2H在斑节对虾卵巢发育过程的作用，可为研究泛素—蛋白酶体通路在斑节对虾卵巢发育的分子机理提供参考依据。【前人研究进展】目前，关于UBE2H基因的研究主要集中在疾病方面，如自闭症（Vourch et al.，2003）、耳聋（Modamio-H■ybj■r et al.，2004）、肌萎缩侧索硬化（Martin et al.，2009）、肝癌（Keng et al.，2009）等，但具体的作用机理尚未得到系统阐述。此外，还有研究表明，在小鼠的骨骼肌细胞中UBE2H基因能协助MG53（Muscle-specific mitsugumin 53）基因使黏着斑激酶蛋白（Focal adhesion kinase，FAK）泛素化降解（Nguyen et al.，2014）。有关泛素结合酶E2的研究已较深入，张莹莹等（2008a）应用H1-U6双启动子RNAi载体筛选到两个人类泛素结合酶hUBE2W的RNAi有效靶点，并进行蛋白水平及mRNA水平的表达检测，结果显示其在睾丸成年期的表达最高；国果等（2014）通过克隆家蝇泛素结合酶基因并进行生物信息学分析，为进一步研究在外界刺激诱导下其功能结构与抗病特性间的关系奠定了理论基础；张西轩等（2014）通过构建人类泛素结合酶UbcH5c的活性位点突变体S22R和F62A，并分析这2种突变体蛋白与野生型蛋白在泛素化反应中的活性差异，结果表明，突变体S22R和F62A均不同程度地改变了人类泛素结合酶UbcH5c与泛素分子间的结合活性；陈学昭等（2015）克隆获得松江鲈泛素结合酶E2-D2基因cDNA序列，并以实时荧光定量PCR检测经鳗弧菌（Vibrio anguillarum）刺激后该基因的表达量，结果显示其在血液、脾脏、肝脏和鳃中均呈上调表达，可能参与了松江鲈的先天免疫防御。近年来，泛素和泛素结合酶在甲壳动物卵巢发育研究也屡见报道，如日本囊对虾（Shen et al.，2009）、日本沼虾（Zhang et al.，2010）、斑节对虾（傅明骏等，2015）等，进一步证实泛素结合酶在甲壳动物卵巢发育过程中发挥着重要作用。【本研究切入点】虽然泛素结合酶在甲壳动物性腺发育中的研究较常见（Shen et al.，2009；Zhang et al.，2010；傅明骏等，2015），但有关UBE2H基因在斑节对虾的卵巢发育中的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】克隆斑节对虾UBE2H基因的开放阅读框，对其进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR检测UBE2H基因的组织特异性表达情况，并构建重组质粒进行原核表达，为进一步揭示UBE2H在斑节对虾卵巢发育过程的分子机理提供依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试斑节对虾（40±5 g）取自南海水产研究所深圳试验基地，采集其脑、胸神经、心脏、肌肉、肝胰腺、鳃、肠道、淋巴组织、精巢、卵巢等组织，加入RNAlater过夜后置于-80 ℃保存，用于基因克隆及组织特异性表达分析。根据黄建华等（2005）的方法进行斑节对虾卵巢不同发育阶段判断，取不同卵巢发育时期斑节对虾（120～200 g）的卵巢和肝胰腺组织，以同样方法保存，用于研究UBE2H基因在斑节对虾卵巢和肝胰腺中的表达情况。

1. 2 RNA提取与逆转录

用TRIzol（Invitrogen公司）提取斑节对虾脑、淋巴、心脏等组织及不同发育期的斑节对虾卵巢、肝胰腺组织RNA，然后分别采用1.0%琼脂糖凝胶电泳及核酸蛋白分析仪Nanodrop 2000进行RNA的质量与浓度检测。同时，取3.0 μg肝胰腺RNA用Prime ScriptTM RT-PCR Kit（TaKaRa公司）逆转录合成cDNA，用于目的基因片段验证；或取1.0 μg各组织RNA，用Prime ScriptTM Real-time PCR Kit（TaKaRa公司）逆转录合成cDNA，用于UBE2H基因表达情况检测。

1. 3 斑节对虾UBE2H基因验证

从斑节对虾肝胰腺转录组数据中筛选获得的UBE2H基因片段，设计针对其开放阅读框的验证引物UBE2H-F（5'-TTGTGTAAAGACGCACTCGG-3'）和UBE2H-R（5'-TCAAACAGATGAGACACAGCCT-3'）。以斑节对虾的cDNA为模版，UBE2H-F和UBE2H-R为引物进行扩增，具体PCR反应体系组成及扩增程序参考PrimeScriptTM RT-PCR Kit的说明。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，然后进行切胶回收。PCR产物与pMD19-T载体16 ℃连接过夜，重组质粒经42 ℃水浴热激后转化至DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆进行扩大培养，PCR检测目的条带正确导入后送至广州华大生物科技有限公司测序。

1. 4 生物信息学分析

利用表1所示的生物信息学软件对克隆获得的目的基因序列进行生物信息学分析。

1. 5 斑节对虾UBE2H基因熒光定量PCR检测

分别以斑节对虾UBE2H基因开放阅读框序列和内参基因18S序列为基础，设计实时荧光定量PCR引物UBE2H-qF（5'-CTTACCCTAACCCGATTGA-3'）和UBE2H-qR（5'-CTTCTTCCGTTGCGTATC-3'）、18S-

qF（5'-GAGACGGCTACCACATCTAAG-3'）和18S-qR（5'-ATACGCTAGTGGAGCTGGA-3'），对斑节对虾各组织、不同发育时期的卵巢及对应时期的肝胰腺组织的UBE2H基因表达量进行检测。实时荧光定量PCR反应体系10.0 μL：5.0 μL SYBR Premix Ex Taq、1.5 μL cDNA模板、0.3 μL上游引物、0.3 μL下游引物，ddH2O补足至10.0 μL；扩增程序参考PrimeScriptTM Real-time PCR Kit的说明。每个样品3个平行，采用2-ΔΔCt法计算UBE2H基因表达量，再以SSPS 18.0进行单因素方差分析。

1. 6 斑节对虾UBE2H原核表达、免疫印迹及蛋白纯化

根据斑节对虾UBE2H基因序列设计原核表达的引物UBE2H-BF（5'-GAATTCATGTCATCACCCAGT

GCAGGA-3'）和UBE2H-BR（5'-GCGGCCGCTTAGAG

CTCCATGTCT-3'），以斑节对虾cDNA为模板进行UBE2H基因克隆，有正确片段插入的菌液扩大培养后提取质粒，然后用EcoR I和Not I酶切UBE2H片段和pET32a载体，凝胶电泳后切胶回收UBE2H基因片段和线性的pET32a载体，用T4连接酶连接后转化大肠杆菌BL21，接种于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜，挑取阳性克隆进行PCR检验和测序鉴定。取阳性重组菌液接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养2 h左右，当其OD达0.4～0.6时加入IPTG至最终浓度为1 mmol/L，30 ℃继续培养诱导表达。分别于诱导表达0、2、4和6 h时取2. 0 mL菌液，以pET32a载体为阴性对照，离心收集菌体，弃上清液后加入200.0 μL PBS重悬菌体，再加50.0 μL的5×上样缓冲液，煮沸10 min，10000×g离心1 min，取10.0 μL上清液进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色后拍照。

按常规方法对IPTG诱导前和诱导后处理过的pET32a-UBE2H重组菌液样品进行SDS-PAGE电泳，然后进行转膜、脱脂奶粉封闭、PBST洗膜、6×His Tag HRP抗体孵育、PBST洗膜、HRP-DAB试剂盒显色及拍照。同时，按原核表达的条件进行pET32a-UBE2H重组蛋白诱导表达，IPTG诱导浓度1 mmol/L，30 ℃培养过夜，细胞破碎仪对诱导后的菌液进行破碎，检测蛋白是否可溶，然后用His-Tagged的Ni2+-NAT亲和层析柱进行纯化（韦友传等，2014），并按蛋白定量试剂盒说明检测纯化蛋白浓度。

2 结果与分析

2. 1 斑节对虾UBE2H基因序列分析结果

斑节对虾UBE2H基因全长1010 bp（GenBank登录号KU870456）。其中，开放阅读框555 bp，编码184个氨基酸；5'非编码区77 bp；3'非编码区378 bp。斑节对虾UBE2H蛋白等电点（pI）4.88，分子量20.85 kD。由UBE2H基因序列结构分析结果可知，其编码该氨基酸序列无信号肽，UBE2H蛋白第87位的半胱氨酸（87Cys）为泛素结合酶特有的活性位点，共含有12个磷酸化位点（142Ser、165Ser、167Ser、169Ser、170Ser、172Ser、175Ser、13Thr、44Thr、

150Thr、137Tyr和144Tyr），且含有一个泛素家族特有的UBCc结构域（图1）。

2. 2 斑节对虾UBE2H蛋白结构预测结果

分别使用PSIPRED和SWISS-MODEL对斑节对虾UBE2H蛋白的二级结构和三级结构进行预测，用蛋白三维结构软件PyMOL对其蛋白序列进行空间三维结构模拟。由图2可知，斑节对虾UBE2H蛋白的二级结构由4个β-片层、6个α-螺旋及连接的无规则卷曲构成，与三级结构的预测结果一致。斑节对虾UBE2H蛋白三级结构与人类的相似度达84.46%，具有很高的相似性。

2. 3 多重序列比对结果

用Bioedit进行多重序列比对，结果如图3所示。斑节对虾UBE2H氨基酸序列与其他物种的相似性很高，说明泛素家族特有的泛素结构域较保守。与斑节对虾相似性最高的是红丽鱼（Pundamilia nyererei）、罗非鱼（Oreochromis niloticus）和非洲爪蟾（Xenopus laevis），相似度为83.00%；其次为斑马鱼（Danio rerio）、人类（Homo sapiens）、白斑狗鱼（Esox lucius）、猕猴（Macaca mulatta）、地山雀（Pseudopodoces humilis）、野猪（Sus scrofa）、豚鼠（Cavia porcellus）、小家鼠（Mus musculus）和家猫（Felis catus），相似度为80.00%；与东方果蝇（Bactrocera dorsalis）的相似度为78.00%。

用MEGA 6.0构建基于UBE2H氨基酸序列的系统发育进化树（图4），结果显示哺乳类（人类、小家鼠等）、鸟类（地山雀）等脊椎动物聚为一支，再与两栖类（非洲爪蟾）聚为一支；鱼类聚为另一支，然后所有脊椎动物聚为一大支；东方果蝇为外群，其进化地位相对低等。系统发育进化树的总体趋势与Bioedit多重序列比对结果一致。

2. 4 斑节对虾UBE2H基因的表达分析结果

2. 4. 1 UBE2H基因在斑节对虾各组织中的表达情况 用实时荧光定量PCR检测UBE2H基因在斑节对虾不同组织中的表达变化，以β-action为内参基因。由图5可知，斑节对虾UBE2H基因在所检测的11种组织（脑、胸神经、心脏、肝胰腺、肌肉、胃、肠、淋巴组织、鳃、精巢和卵巢等）中均有表达，其中以淋巴组织的表达量最高，鳃次之，与其他组织的表达水平存在显著差异（P< 0.05，下同）；其他组织中的表达差异不显著（P>0.05，下同）。

2. 4. 2 UBE2H基因在斑节对虾不同卵巢发育期卵巢和肝胰腺中的表达情况 UBE2H基因在斑节对虾不同卵巢发育期肝胰腺中的表达量呈先上升后下降的变化趋势（图6-A），在卵巢I、II期对应的肝胰腺中其表达量平稳，在卵巢III期对应肝胰腺中表达显著升高，是卵巢I期肝胰腺中表达量的1.9倍；随后在卵巢IV、V期对应肝胰腺中表达量下降，显著低于卵巢I期。UBE2H基因在斑节对虾卵巢中的表达量也呈先上升后下降的变化趋势（图6-B），但以II期卵巢的表达量最高，为I期的3.0倍左右，其余发育期的表达差异不显著。

2. 5 斑节对虾UBE2H基因原核表达、免疫印迹及蛋白纯化结果

30 ℃下以1 mmol/L IPTG诱导重组质粒pET32a- UBE2H，并对诱导表达产物进行SDS-PAGE电泳检测，结果发现诱导2 h后开始出现明显的表达蛋白条带，但蛋白表达量较诱导4和6 h后的少（图7-A）。采用Western blotting进行验证，结果表明，重组质粒诱导表达的蛋白可检测到His Tag，且条带大小在39.00 kD左右（图7-B），与预期结果相符。将纯化后的蛋白分管保存，再进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示，斑节对虾UBE2H融合蛋白条带单一，且目的条带大小在39.00 kD左右，与预期结果一致。试剂盒检测得知斑节对虾UBE2H融合蛋白浓度为2.92 μg/μL。

3 讨论

目前，泛素结合酶在人类免疫疾病研究中较常见，如在艾滋病（VerPlank et al.，2001）、T细胞白血病（Shembade et al.，2007）及肿瘤坏死因子介导的炎症反应（Fukushima et al.，2007）；在甲壳动物中也有类似报道。陈安静（2013）研究表明，中国明对虾泛素结合酶E2能介导白斑综合征病毒含有RING结构域蛋白的泛素化，并抑制病毒复制。本研究克隆获得的斑节对虾UBE2H基因全长1010 bp，含有一个泛素家族特有的UBCc结构域，与陈学昭等（2015）发现松江鲈（Trachidermus fasciatus）泛素结合酶E2-D2基因的cDNA序列中含有一个UBCc结构域的研究结果一致。综合多重序列比对和系统发育进化树分析结果可知，斑节对虾UBE2H氨基酸序列与其他物种的相似度很高（78.00%～83.00%），说明在物种进化过程中UBCc结构域较保守（Sheng et al.，2012）。斑节对虾UBE2H基因的组织特异性表达结果显示，该基因在各组织中均有表达，但以淋巴组织表达量最高，鳃次之。淋巴组织和鳃是斑节对虾主要的免疫器官，由此推测UBE2H基因的主要作用与斑节对虾的免疫相关。

泛素—蛋白酶系统具有炎症调节、免疫应答、细胞周期、信号转导等重要生物学功能，在甲壳动物性腺发育过程中发挥重要作用。如日本囊对虾的泛素缀合酶E2r在卵巢发育III期的表达量最高，推测其在生殖细胞发育过程中发挥极其重要的作用（Shen et al.，2009）；中华绒螯蟹泛素结合酶Ubc9基因在卵巢发育III期的表达量达最高值，但在IV期逐渐降到最低值（Wang et al.，2012）；斑节对虾Ubc基因在卵巢发育III期的表达量最高，IV期开始降低（傅明骏等，2015）。为了阐明UBE2H在斑节对虾卵巢发育过程中的作用，本研究采用实时荧光定量PCR对UBE2H基因在斑节对虾不同卵巢发育期卵巢和肝胰腺中的表达情况进行分析，其结果显示斑节对虾UBE2H基因在卵巢II期的表达量最高。斑节对虾卵巢发育II期为核染色质期，是机体累积能量、卵母细胞发育的过程；III期为周边核仁期，是卵母细胞快速发育、累积卵黄蛋白的时期（黄建华等，2005）。因此，推测UBE2H参与了斑节对虾卵巢发育与能量积累的过程。在十足类甲壳动物的卵巢发育过程中，肝胰腺可合成卵黄蛋白原，并通过血淋巴组织运送到卵巢组织（陈金民等，2010）；但Tseng等（2001）、Hiransuchalert等（2013）研究表明，斑节对虾的卵巢和肝胰腺均能合成卵黄蛋白原。本研究也发现，UBE2H基因在斑节对虾卵巢发育III期对应肝胰腺中的表达量最高，故推测UBE2H参与斑节对虾中卵黄蛋白原从肝胰腺到卵巢的转运过程。

为进一步探究斑节对虾UBE2H的生物学活性和蛋白表达情况，本研究还构建了pET32a-UBE2H重组质粒，并以IPTG诱导表达出约39.00 kD的融合蛋白，其氨基端有一個6个组氨酸构成的His Tag和一个19.00 kD左右的硫氧还蛋白。该结果为下一步的抗体制备、卵巢组织免疫组化研究打下了基础。

4 结论

斑节对虾UBE2H参与了其卵母细胞发育和肝胰腺中卵黄蛋白的转运过程，与斑节对虾的卵巢发育有着密切关系，为下一步研究斑节对虾卵巢发育的分子机制提供了参考依据。

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（責任编辑 兰宗宝）