家蚕感染球孢白僵菌后4种抗菌肽基因的表达分析

吕丁丁 侯成香 耿涛 黄玉霞 覃光星 高坤 郭锡杰

摘要：【目的】阐明家蚕（Bombyx mori）抗菌肽对球孢白僵菌感染的应答模式，为揭示家蚕及鳞翅目昆虫抗真菌机制提供参考依据。【方法】利用实时荧光定量PCR检测家蚕被球孢白僵菌感染后抗菌肽基因cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme的表达情况，比较4种抗菌肽在家蚕脂肪体、血淋巴、马氏管和中肠中不同时间点的表达差异。【结果】经球孢白僵菌诱导后，cecropinA基因在家蚕脂肪体中的最高上调表达倍数为10.2倍，在血淋巴中的最高上调表达倍数为13.2倍，在马氏管中感染初期显著上调表达（P<0.05，下同），在中肠中感染后期顯著上调表达；gloverin2基因在家蚕脂肪体中出现2次上调表达过程，最高上调表达倍数为15.7倍，在血淋巴中感染前期呈上调表达，在马氏管中略呈下调表达，中肠中的gloverin2基因在接种后16～48 h呈显著上调表达，最高上调表达倍数为6.7倍；lebocin1/2基因在家蚕脂肪体和血淋巴中的最高上调表达倍数分别为19.4和22.4倍，在马氏管中仅在接种后16 h呈显著上调表达，在中肠中则是接种后24～48 h呈显著上调表达；lysozyme基因在家蚕脂肪体中显著上调表达，在血淋巴和马氏管中感染初期也呈显著上调表达，但在中肠中的表达无明显规律。【结论】cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme基因在球孢白僵菌侵染家蚕的过程中均不同程度地被诱导上调表达，尤其在家蚕脂肪体和血淋巴中较明显，由此推测这4种抗菌肽在抵御球孢白僵菌的侵染过程中发挥重要作用。

关键词： 家蚕；球孢白僵菌；抗菌肽；表达水平

中图分类号： S884.31 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）11-1952-06

Abstract：【Objective】The present study was conducted to evaluate response pattern of antimicrobial peptides in Bombyx mori against Beauveria bassiana infection in order to provide beneficial reference for researches on antifungal mechanism of B. mori and other lepidoptera insects. 【Method】The expression patterns of antimicrobial peptide genes cecropinA， gloverin2， lebocin1/2 and lysozyme in B. mori after being infected with B. bassiana were detected using real-time fluorescence quantitative PCR. The differential expressions of the four antimicrobial peptide genes in fat body， hemolymph， malpighian tubule and midgut at different time points were compared. 【Result】After being induced by B. bassiana， the expression of cecropinA was up-regulated by 10.2 times to the maximum in fat body and 13.2 times to maximum in hemolymph. The expression of cecropinA was also significantly up-regulated in malpighian tubule at early stage of the infection（P<0.05， the same below）， and in midgut at middle-late stages of the infection. Up-regulated expression of gloverin2 occurred twice in fat body and the maximum re-regulated expression multiple was 15.7 times. The expression of gloverin2 up-regulated in hemolymph at earlier stage but down-regulated in malpighian tubule. It also up-regulated in mindgut after 16-48 hours of infection， with maximum up-regulated multiples reaching 6.7 times. The expression of lebocin1/2 up-regulated in fat body by 19.4 times to utmost limit and by 22.4 times to the maximum in hemolymph. It also up-regulated significantly in malpighian tubule after 16 hours of infection and in midgut after 24-48 hours of infection. The expression of lysozyme significantly up-regulated in fat body， and also significantly up-regulated in hemolymph and malpighian tubule at earlier stage of infection. But the expression in midgut showed no obvious regulation. 【Conclusion】The expressions of antimicrobial peptide genes cecropinA， gloverin2， lebocin1/2 and lysozyme up-regulated to different extents after B. mori infected by B. bassiana， especially in fat body and hemolymph of B. mori. The results suggest that cecropinA， gloverin2， lebocin1/2 and lysozyme may play important roles in B. mori antifungal process against B. bassiana infection.

Key words： Bombyx mori； Beauveria bassiana； antimicrobial peptide； expression characteristics

0 引言

【研究意义】家蚕（Bombyx mori）的先天性免疫系统包括细胞免疫应答和体液免疫应答。体液免疫应答主要是合成和释放若干抗微生物肽分子，而这些抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）均产生于脂肪体、血细胞及上皮组织（吕鸿声，2008）。家蠶抗菌肽在正常情况下不表达或呈低水平的组成型表达，一旦有外界微生物入侵，即在体内迅速合成与释放，参与免疫反应。白僵病是危害最严重、病势最急的一种家蚕真菌性传染病（吕鸿声等，1990），研究家蚕抗菌肽对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）感染的应答模式，对阐明家蚕对白僵菌的体液免疫机制及其防治具有重要意义。【前人研究进展】自1981年Boman和Steiner在惜古比天蚕（Hyatophora cecropia）中发现可诱导抗微生物肽以来，目前已从家蚕中分离鉴定出多种可诱导抗菌肽，如cecropins、defensins、lebocins、gloverins等（Yamano et al.，1994；Chowdhury et al.，1995；Cheng et al.，2006；Kaneko et al.，2007， 2008）。当昆虫受到免疫刺激时，溶菌酶（lysozymes）在其体内含量迅速升高，并参与免疫应答，因此也常被视为免疫分子（吕鸿声，2008）。目前，已有研究证实家蚕抗菌肽对革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌均有抑菌作用（Zhang et al.，1999；Cheng et al.，2006；Xia et al.，2013；姚远等，2014），但能抑制真菌的家蚕抗菌肽仅有cecropin类，如化学合成的cecropin多肽对马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）等植物病原真菌具有较强的抑菌作用（Cavallarin et al.，1998），而原核表达的家蚕cecropinA在体内外对昆虫病原真菌球孢白僵菌均具有抗菌作用（Lu et al.，2016）。【本研究切入点】家蚕cecropin类抗菌肽能被革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌及真菌诱导上调表达，但不能被病毒诱导表达（Cheng et al.，2006；Hong et al.，2008）；家蚕脂肪体、马氏管组织中的gloverin基因能被大肠杆菌诱导上调表达（Kaneko et al.，2007），中肠中的gloverin基因能被家蚕核型多角体病毒诱导上调表达（唐芬芬等，2015）；家蚕脂肪体、中肠、马氏管、血淋巴中的lebocin基因被大肠杆菌诱导后显著上调表达（Tanaka et al.，2012）；家蚕脂肪体、血淋巴和表皮中的lysozyme基因能被革兰氏阳性细菌诱导上调表达（Lee and Brey，1995）。但这4类抗菌肽在家蚕不同组织中被真菌诱导表达的机制研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以球孢白僵菌接种家蚕后，利用实时荧光定量PCR检测家蚕体内抗菌肽基因cecropinA、gloverin2、lebocin1/2、lysozyme的表达情况，比较4种抗菌肽在家蚕脂肪体、血淋巴、马氏管和中肠中不同时间点的表达差异，阐明家蚕抗菌肽对球孢白僵菌感染的应答模式，为揭示家蚕及鳞翅目昆虫抗真菌机制提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试家蚕品种p50由中国农业科学院蚕业研究所保存并饲养。球孢白僵菌HN6菌株由中国农业科学院蚕业研究所病理室保存提供，其寄主是家蚕，试验前经家蚕复壮。Taq DNA聚合酶、RNApure Ultrapure Total RNA Extraction Kit购自北京博凌科为生物科技有限公司；Ex Taq■、RNAiso Plus、PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA Ligation Kit Ver.2.1、SYBR Premix Ex TaqTM Kit等购自TaKaRa公司。

1. 2 球孢白僵菌接种及家蚕组织收集

HN6菌株在PDA培养基中25 ℃培养7～10 d后，用小钥勺将培养基上的孢子刮取到200.0 mL含0.01% Tween-20的灭菌ddH2O中，漩涡振荡至孢子分散，再用加有3层无菌脱脂棉的50.0 mL注射器过滤孢悬液，对过滤获得的孢悬液进行梯度稀释并计数，将其浓度调至1×108个/mL。试验组取350头5龄起蚕，在孢悬液中浸泡接种15 s后迅速捞起并滤去多余的孢悬液，放置在正常环境进行饲养；对照组的350头家蚕在含0.02% Tween-20的灭菌ddH2O中浸泡15 s。为防止细菌感染家蚕，孢悬液和对照品的无菌水均添加青霉素—链霉素混合溶液。

分别于接种后8、12、16、20、24、30、36、42、48和54 h取材，试验组和对照组设3个重复，每个重复取10头家蚕。首先将家蚕置于冰上2 min，剪去一只腹足，收集血淋巴，装入含0.5 mL RNAiso Plus的冻存管中，再将家蚕固定到解剖台上，分别解剖收集脂肪体、马氏管和中肠，组织样品均用0.9%生理盐水浸泡洗涤，再装入含0.5 mL RNAiso Plus的冻存管中。装有组织样品的冻存管先放入液氮中速冻，然后-80 ℃保存备用。

1. 3 总RNA提取及cDNA第一链合成

将各组织样品自然解冻，加入200 μL RNAiso Plus，置于冰上用匀浆机充分匀浆破碎，加入RNAiso Plus，血淋巴样品需用1.0 mL注射器反复吹打，再根据RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒说明提取总RNA，检测RNA浓度、纯度及其完整性。调整各样品组织总RNA浓度，根据PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒操作说明合成cDNA第一链，并以管家基因actin引物对cDNA模板进行PCR检测。

1. 4 选取靶基因及其引物设计

针对家蚕的cecropin类抗菌肽，选取cecropinA基因（NM_001043997.1）为靶基因；针对gloverin类抗菌肽，选取gloverin2基因（NM_001044218.2）为靶基因；针对lebocin类抗菌肽，选取lebocin1/2基因（NM_001044003.1）为靶基因；针对lysozyme类抗菌肽，选取lysozyme基因（L37416.1）为靶基因。根据实时荧光定量PCR引物设计原则，利用Primer Premier 5.0对4个抗菌肽基因进行引物设计（表1），以家蚕管家基因actinA3（NM_001126254.1）为内参基因。

1. 5 实时荧光定量PCR检测

实时荧光定量PCR反应体系20.0 μL：10.0 μL 2×SYBR Premix Ex Taq，0.4 μL 50×ROX Reference Dye，0.5 μL正、反向引物（10 μmol/L），1.0 μL稀释100倍的cDNA模板，ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，进行45个循环。然后按照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明在Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System上进行检测，每个样品重复3次。获得的试验数据采用2-ΔΔCt法进行分析（Livak and Schmittgen，2001）。

1. 6 统计分析

实时荧光定量PCR检测结果以RQ Study Application Version 1.4进行分析，并采用SPSS 19.0进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 球孢白僵菌对家蚕的感染致病情况

5龄家蚕在接种球孢白僵菌HN6菌株后48 h开始有部分家蚕体表出现油斑，食欲下降，并伴有吐液现象，约在接种后80 h试验组的所有家蚕体表均出现大面积油斑（图1-B），濒临死亡，至96 h后试验组家蚕全部死亡。随机挑选5头死亡家蚕穿刺腹足采集血淋巴镜检，结果发现死亡家蚕血淋巴中有大量球孢白僵菌的芽生孢子和营养菌丝（图1-A）。将病蚕尸体放在保湿的培养皿中3～4 d后，所有蚕尸体表面布满白色菌丝和孢子（图1-C）。对照组家蚕未出现油斑和死亡现象，且能正常结茧化蛹。

2. 2 接种球孢白僵菌对家蚕cecropinA基因相对表达水平的影响

以实时荧光定量PCR检测球孢白僵菌感染后家蚕脂肪體、血淋巴、马氏管和中肠4个组织中cecropinA基因的相对表达水平，将各时间点对照组家蚕cecropinA基因的相对表达量设为1.0。当靶基因的相对表达量大于1.0时即为上调表达，反之为下调表达。从图2可看出，接种球孢白僵菌后，家蚕脂肪体中cecropinA基因于接种后20 h上调表达约10.2倍，然后表达水平回落；在血淋巴中cecropinA基因的相对表达水平显著上调（P<0.05，下同），接种后8、24和54 h的表达水平分别上调约9.5、13.2和12.1倍，说明家蚕在抵御球孢白僵菌侵染过程中，其脂肪体和血淋巴中的cecropinA抗菌体发挥了重要作用。cecropinA基因在马氏管中也呈上调表达，但上调表达水平没有在脂肪体和血淋巴中的明显，且随着时间的推移上调表达水平逐渐下降，至接种后24 h时甚至呈下调表达；在中肠中，cecropinA基因初期呈下调表达，之后明显上调表达，但上调倍数不及脂肪体和血淋巴。说明家蚕马氏管中cecropinA抗菌体在感染初期可能对抵御球孢白僵菌起到一定作用，而中肠中的cecropinA抗菌体在感染中后期对抵御球孢白僵菌可能起到重要作用。

2. 3 接种球孢白僵菌对家蚕gloverin2基因相对表达水平的影响

从图3可看出，在球孢白僵菌的诱导下，家蚕脂肪体和中肠中gloverin2基因的相对表达水平绝大部分时间点呈显著上调表达，尤其在脂肪体中gloverin2基因的最高上调表达为15.7倍；在感染初期，中肠中该基因的上调表达水平逐渐提高，至接种后20 h达最高上调表达倍数（6.7倍），然后上调表达水平逐渐回落。在血淋巴中的gloverin2基因仅在接种后12～30 h呈显著上调表达，且上调表达倍数不及在脂肪体和中肠中的表达水平高，其他时间点略呈下调表达。在马氏管中，gloverin2基因未被球孢白僵菌诱导上调表达，而略呈下调表达。球孢白僵菌的感染可能激活了家蚕脂肪体、中肠、血淋巴中gloverin2基因的转录，翻译合成大量gloverin抗菌肽以抵御入侵的球孢白僵菌，而家蚕马氏管中gloverin2基因可能未参与抵御过程。

2. 4 接种球孢白僵菌对家蚕lebocin1/2基因相对表达水平的影响

由图4可看出，在球孢白僵菌诱导下，从接种后16 h起家蚕脂肪体中lebocin1/2基因的表达水平均显著上调表达，最高上调倍数达19.4倍（接种后24 h），高于cecropinA和gloverin2基因在脂肪体中的最高上调表达倍数。在血淋巴中，lebocin1/2基因在接种后8～42 h也呈显著上调表达，最高上调表达倍数（22.4倍）也高于cecropinA（13.1倍）和gloverin2基因（2.6倍），说明lebocin1/2抗菌肽在家蚕抵御球孢白僵菌的体液免疫过程中发挥重要作用。lebocin1/2基因在马氏管中仅在接种后16 h上调2.8倍，可能在家蚕马氏管中lebocin1/2基因没有或未全程参与抵御球孢白僵菌的免疫应答过程。在中肠免疫应答中，lebocin1/2基因可能在接种后24～48 h参与了免疫应答。

2. 5 接种球孢白僵菌对家蚕lysozyme基因相对表达水平的影响

由图5可看出，在球孢白僵菌的诱导下，家蚕脂肪体中lysozyme基因从接种后16 h开始呈显著上调表达，且出现两个上调表达高峰，最高上调表达倍数为4.6倍；在血淋巴中，lysozyme基因初期呈显著上调表达，然后上调表达水平逐渐回落；在马氏管中lysozyme基因也是初期逐渐上调表达，至接种后24 h达最高上调表达水平，然后上调表达水平逐渐回落；lysozyme基因在中肠中的表达无明显规律，仅在个别时间点呈上调表达，大部分时间点呈下调表达。在家蚕抵御球孢白僵菌的免疫反应中，lysozyme基因的相对表达变化虽然不及cecropinA、 gloverin2和lebocin1/2基因明显，但其在抵御球孢白僵菌入侵过程中也发挥了重要作用，尤其在脂肪体和血淋巴中。

3 讨论

正常情况下，球孢白僵菌约在接种感染8 h后能侵入家蚕体表。因此，本研究从球孢白僵菌孢悬液侵染家蚕8 h后开始取材，动态观察球孢白僵菌在整个侵染致病过程中对家蚕抗菌肽基因表达的影响，结果表明，在家蚕脂肪体中，接种后8和12 h两个时间点gloverin2、lebocin1/2和lysozyme基因均未表现出上调表达，cecropinA基因虽呈上调表达，但上调表达倍数不高；在血淋巴中，接种后8和12 h两个时间点4种抗菌肽均呈显著上调表达，说明血淋巴中的抗菌肽最先被诱导合成，进而快速参与免疫应答过程，而脂肪体中抗菌肽需在接种后16 h才开始显著上调表达，然后分泌到血淋巴中，以抵御入侵的球孢白僵菌。

虽然4种抗菌肽在球孢白僵菌的诱导下均能上调表达，但在脂肪体和血淋巴中，lebocin1/2基因的上调表达水平明显高于cecropinA、gloverin2和lysozyme基因，说明在抵御球孢白僵菌侵染过程中，lebocin1/2抗菌肽可能发挥了更重要的作用。Rao等（2012）研究表明，化学合成的lebocin短肽对致病真菌新型隐球酵母（Cryptococcus neoformans）有明显的抑菌活性。因此，在家蚕抗真菌机制及蚕药研发中可将lebocin1/2基因作为一个重要的研究对象。在家蚕中肠中，球孢白僵菌能诱导抗菌肽上调表达，说明感染球孢白僵菌能引起家蚕肠道的免疫反应，且gloverin2和lebocin1/2抗菌肽可能在肠道免疫中发挥了更重要的作用。在家蚕马氏管中，除lysozyme基因外，其他3种抗菌肽基因对球孢白僵菌的诱导应答不明显，大多数时期呈下调表达。McGettigan等（2005）研究报道，果蝇马氏管能独立于脂肪体，且作为自主免疫组织能被细菌诱导表达抗菌肽。因此，推测在家蚕抵抗微生物入侵的过程中，发挥免疫的組织主要是脂肪体、血淋巴和中肠。

本研究还发现，除血淋巴的cecropinA基因在接种后54 h仍处于持续上调表达趋势外，其他3种抗菌肽在脂肪体、血淋巴、中肠感染后期均呈上调表达水平逐渐回落趋势，推测在感染后期，球孢白僵菌在家蚕体内的增殖抑制了家蚕的一系列免疫保护反应，或是家蚕自身为防止过度免疫而造成的现象（Welchman et al.，2009）。不同家蚕组织在感染球孢白僵菌后，4种抗菌肽基因相对表达水平随时间的变化也不同，说明不同组织对球孢白僵菌有不同的防御机制，即对外来微生物的抵御是一个多免疫组织与多免疫因子协作的过程。家蚕被球孢白僵菌感染后，cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme等4种抗菌肽基因均被诱导上调表达，故推测这4种抗菌肽对球孢白僵菌具有一定的抑杀作用。本课题组前期已证明，用原核表达和化学合成的抗菌肽cecropinA在体内和体外对球孢白僵菌均具有较强的抑制作用（Lu et al.，2016），但关于lebocin1/2、gloverin2和lysozyme抗菌肽是否对球孢白僵菌具有抑杀作用，尚需进一步研究证实。

4 结论

cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme基因在球孢白僵菌侵染家蚕的过程中均不同程度地被诱导上调表达，尤其在家蚕脂肪体和血淋巴中较明显，由此推测这4种抗菌肽在抵御球孢白僵菌的侵染过程中发挥重要作用。

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（責任编辑 兰宗宝）