火龙果花中多酚类化合物抗氧化活性研究

李国胜 张伟敏

摘 要 对火龙果花中多酚类化合物抗氧化活性进行研究。采用抗氧化能力的体外实验方法，研究火龙果花中多酚类化合物的还原能力、清除·OH、O2-、 DPPH·和ABTS·四种自由基的能力，以评价其抗氧化性，并以BHT作为阳性对照。结果表明，火龙果花中多酚类化合物抗氧化能力与浓度（0.4～0.8 mg/mL）呈量效关系。虽总体抗氧化活性较弱于BHT，但总体趋势与BHT相同，在浓度为0.7 mg/mL时，其羟自由基清除活性甚至略高于对比溶液。因此，火龙果花中多酚类化合物具有较好的抗氧化活性，可进一步研究开发为抗氧化功能性食品。

关键词 火龙果花 ；多酚类化合物 ；抗氧化活性 ；自由基 ；还原能力

分类号 S667.9 ；R96 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.02.002

Antioxidant Activity of Pitaya Flower Polyphenol Compounds

LI Guosheng ZHANG Weimin

（College of Food Science， Hainan University， Haikou， Hainan 570228）

Abstract The pitaya flower polyphenol compounds in antioxidant activity were studied. Using antioxidant activity in vitro methods， research the pitaya flower polyphenol compounds in reducing power， scavenging·OH， O2-， DPPH， ABTS· four kinds of free radical ability to evaluate its antioxidant and BHT as the positive control.The results showed that pitaya flower polyphenol compounds in antioxidant capacity and concentration （0.4～08 mg/mL） assumes the concentration-response relationship. Although the overall antioxidant activity is less than BHT， but the overall trend is the same as BHT， at the concentration is 0.7 mg/mL， the scavenging hydroxyl radical scavenging activity and even slightly higher than the contrast solution. Therefore， pitaya flower polyphenol compounds has good antioxidant activity， could be further studied and developed for antioxidant functional food.

Keywords pitaya flower ； polyphenols ； antioxidant activity ； free radicals ； reducing power

火龙果（pitaya）又称红龙果、仙蜜果、情人果等，为仙人掌科量天尺属（Hylocereus）或蛇鞭柱属（Selenicereus）的果用栽培品种[1]，原产哥斯达黎加、尼加拉瓜、墨西哥、 古巴等中美洲沙漠地区，目前我国台湾、广东、广西、海南、福建、贵州等地有广泛栽培。火龙果花朵巨大光洁，营养丰富，药用成分广泛，其营养成分包含人体必需的氨基酸、维生素、膳食纤维、蛋白质等，药用成分主要为多酚、黄酮、三萜类化合物等活性物质，具有抑菌抗癌、清热解毒、降低三高等功效[2]。作为一种新食品资源，备受消费者的青睐，同时也受到国内外科研工作者的广泛关注。近年来对其开展的研究较为活跃。已报道的文献有火龙果花营养成分分析、火龙果花的干制[3]、火龙果花保健饮料制作[4]等。夏杏洲等[5]建立了热风干燥和微波干燥干制火龙果花的工艺条件：用 100℃水蒸气处理0.5 min；采用变温干燥方法：60℃，0.5 h→70℃，1.0 h→55℃，0～2.0 h或者微波干燥方式：装载量0.25 kg，微波强度700 W，时间11.6 min，可以获得复水性好、营养成分保存率高、品质优良的火龙果花干品。

多酚类化合物的主要功能性质是作为许多酶体系的抑制剂或激活剂、金属螯合剂以及自由基清除剂[6]。多酚类化合物通过酚羟基的离解和自由基途径产生抗氧化作用，是医药、食品、化妆品中很有前景的一类天然抗氧化剂和自由基清除剂。现有许多测试抗氧化活性的方法，如DPPH检测法，ABTS检测法，超氧阴离子检测法等。DPPH检测法的根据为DPPH自由基于517 nm处有一强吸收峰，其醇溶液呈紫色的特性。当抗氧化剂存在时，通过使DPPH分子中1个稳定自由基与抗氧化剂提供的1个电子配对结合使DPPH的特征紫色消失，褪色的程度和自由基清除剂的电子数量存在定量关系，因此，可用分光光度计进行定量分析[7]；而ABTS自由基既是亲水型化合物又是亲脂型化合物，所以较DPPH自由基更容易反应，ABTS·的清除是电子转移过程，体系中的抗氧化剂与其反应将会使溶液褪色，表现为吸光值的降低[8]。测定超氧阴离子自由基清除活性常用邻苯三酚自氧化法[9]。本实验以火龙果花为原料，采用5种体外抗氧化评价方法测定多酚类化合物的抗氧化性能，以期为火龙果花中多酚类化合物的利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

火龙果花，市售袋装干货制品，于50℃下烘干，中药粉碎机粉碎后，过50目筛，放入干燥器中备用。

HH-4数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司生产）、YHG型远红外快速恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂生产）、722紫外可见分光光度计（上海奥谱勒仪器有限公司生产）、GL-20G-II型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂生产）、AL204电子天平[梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司生产]、中药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司生产）、索氏抽提装置。

没食子酸标准品[Aladdin-阿拉丁试剂（上海）有限公司生产]、乙醇（95%）（AR）（广州化学试剂厂生产）、无水碳酸钠（AR）（天津市诺克科技发展有限公司生产）、福林酚（北京索莱宝科技有限公司生产）、石油醚（沸程30～60℃）（AR）（天津市大茂化学试剂厂生产）；无水乙醇、Tris、无水氯化铝、BHT、抗坏血酸、DPPH、绿矾、水杨酸、ABTS、双氧水、邻苯三酚、K2S2O8、柠檬酸、氯化亚铁、浓盐酸、铁氰化钾、三氯乙酸均为市售分析纯。实验用水为去离子水。

1.2 方法

1.2.1 提取物制备

为去除脂溶性色素等干扰，将火龙果花干品用石油醚在50℃下索氏抽提4 h，挥干溶剂，放入干燥器中备用。

称取1.0 g处理后的火龙果花干品置于250 mL圆底烧瓶中，加入40 mL 50%的乙醇溶液，50℃条件下加热回流提取40 min后，将提取液3 000 r/min离心5 min，取上清液，定容至50 mL备用。

1.2.2 总多酚含量测定

1.2.2.1 多酚标准曲线绘制

采用福林酚法[10]：将0.002 5 g没食子酸溶于蒸馏水并定容至250 mL。分别移取1、2、3、4、5、6 mL没食子酸溶液于10 mL容量瓶中。上述溶液可以分别表示没食子酸浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的标准溶液，加入1 mL Folin-Ciocalteu试剂，混合，在3～4 min内，加入2 mL 10%碳酸钠溶液，混合后定容。将上述溶液在室温下避光放置100 min后，于760 nm波长下测定吸光值A。同时做空白对照。以没食子酸的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制没食子酸的标准曲线，求线性回归方程。

测得其回归方程为y=9.251 4 x+0.056 5。

1.2.2.2 总多酚测定

根据得到的标准曲线，计算火龙果花干中总多酚的含量（以没食子酸计）。

总多酚含量（以没食子酸计，m/g）=（A1×V1）/W。

其中：A1为提取液中多酚的浓度（mg/mL）；V1为提取液总体积（mL），W为样品质量（g）。

1.2.3 火龙果花中多酚类化合物抗氧化活性研究

1.2.3.1 对DPPH自由基清除活性的测定[11]

DPPH标准溶液的配制：用无水乙醇溶解5.947 mg DPPH并定容于50 mL的棕色容量瓶中，得浓度为118.94 mg/L DPPH贮备液，摇匀并避光保存以备用。

取7支10 mL容量瓶，编号，各加入2.0 mL不同浓度样品溶液，分别加入2.0 mL浓度为118.94 mg/L的DPPH溶液，摇匀后反应30 min，在517 nm处测定其吸光度A1。以2.0 mL无水乙醇代替DPPH的吸光度为A2，以2.0 mL的去离子水代替样品溶液的吸光度为A0，以BHT作为阳性对照。清除DPPH·自由基活力公式为：

清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100%

其中，样品溶液吸光度为A1；以无水乙醇代替DPPH的吸光度为A2；以去离子水代替样品溶液的吸光度为A0。

1.2.3.2 对羟自由基清除活性的测定[12]

10 mmol/L FeSO4溶液的配制：用去离子水溶解绿矾0.139 g，定容于50 mL容量瓶中。

5 mmol/L水杨酸-乙醇溶液的配制：称取0.069 g水杨酸，用乙醇溶解，并用去离子水定容于100 mL容量瓶。

取7支具塞试管，分别加入10 mmol/L FeSO4 1.0 mL和5 mol/L水杨酸-乙醇溶剂2.0 mL，混匀，再分别加入各浓度的样品溶液1.0 mL，之后再加入0.1%的H2O2溶液1.0 mL，去离子水定容至10 mL，在37℃水浴中恒温反应30 min后，于波长510 nm处测定其吸光度值为A1，以去离子水代替试样的吸光度为A2，以去离子水代替试样及H2O2的吸光度为A0，以消除样品本身影响，以BHT作为对照。清除羟自由基活力公式为：

清除率（%）=[A0-（A1-A2）]/A0×100%

其中，样品吸光度值为A1；以去离子水代替试样的吸光度为A2；以去离子水代替试样及H2O2的吸光度为A0。

1.2.3.3 对ABTS自由基清除活性的测定[13]

用去离子水将ABTS配制成7 mmol/L储备液，加入K2S2O8固体， 使储备液中K2S2O8浓度达到2.45 mmol/L，于室温避光放置2 d备用；用 0.01 mol/L的 PBS（pH7.4）稀释，使其在732 nm下测得吸光度在（0.700±0.050）范围内；将0.05 mL不同浓度的样品溶液，混合1.9 mL ABTS溶液，在室温下放置3 min后测其吸光度，BHT做阳性对照。

清除率（%）=[（A0-A1）/A0]×100%

其中，A0为不加样液的ABTS溶液的吸光度；A1为加入样品溶液的吸光度。

1.2.3.4 对超氧阴离子自由基清除活性的测定[14]

10 mmol/L盐酸溶液的配制：用移液管精确吸取0.09 mL浓盐酸，用去离子水稀释并定容于100 mL容量瓶中即得。

25 mmol/L邻苯三酚溶液的配制：准确称取0.157 6 g邻苯三酚粉末，用已经配制好的10 mmol/L盐酸溶液溶解并定容于50 mL容量瓶中即得。

0.1 mol/L Tris溶液的配制：准确称取0.302 8 g Tris粉末，用去离子水溶解并定容于25 mL容量瓶中即得。

pH 8.2的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液配制：量取已配制的0.1 mol/L Tris溶液25 mL和已配制好的0.1 mol/L盐酸溶液11.45 mL，混合，摇匀后用去离子水定容于50 mL容量瓶中，即得0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液。

取4 mL pH 8.2的50 mmo1/L Tris-HC1缓冲溶液，25℃水浴锅中水浴20 min后取出，加入0.4 mL样品溶液和0.4 mL 25℃预热的25 mmo1/L邻苯三酚溶液，在波长325 nm处测定吸光度A1，以0.4 mL去离子水代替样品溶液，测得吸光度为A0，以0.4 mL 10 mmol/L的盐酸溶液代替25 mmo1/L邻苯三酚溶液，测得吸光度为A2，以BHT作为对照。清除超氧阴离子自由基活力可用以下公式表示：

清除率（%）=[A0-（A1-A2）]/A0×100%

其中，样品吸光度为A1；以0.4 mL 10 mmol/L的盐酸溶液代替25 mmo1/L邻苯三酚溶液，测得吸光度为A2；以0.4 mL去离子水代替样品溶液，测得吸光度为A0。

1.2.3.5 还原能力的测定[15]

用移液管吸取1.00 mL样品溶液置于25 mL具塞试管中，再加人pH 6. 6的磷酸盐缓冲液2.50 mL和1%铁氰化钾溶液2.50 mL，混匀。在50℃水浴中，放置20 min。然后向试管中加人10%三氯乙酸溶液2.50 mL，混匀后以3 000 r/min离心10 min，最后分别量取2.50 mL混合液、蒸馏水和0.1%氯化铁溶液于试管中，混匀，静置10 min。在700 nm处测定吸光度为A1，以80%乙醇试剂代替试样作为空白对照，其吸光度为A0，以BHT作为对照。

总还原能力为 A1-A0。

其中：样品吸光度为A1，以80%乙醇试剂代替试样作为空白对照，其吸光度为A0。

2 结果与分析

2.1 对DPPH自由基清除活性的测定

由图1可看出，样品溶液自由基清除能力与其浓度成正比。浓度在0.4～0.6 mg/mL时，样品溶液对DPPH自由基清除率与BHT不相上下，甚至在浓度为0.5 mg/mL时，样品溶液的清除率（74.24%）还略高于对比溶液（68.30%）。当样品溶液表现最强清除能力时，浓度为0.7 mg/mL，清除率达到78.45%，但较弱于阳性对照BHT（93.59%）。且在该浓度后，样品溶液曲线呈下降趋势，对比溶液仍缓慢上升。由于样品溶液中多酚类化合物仅是粗提取产物，因此，其他杂质可能会使溶液清除率受到影响。

2.2 对羟自由基清除活性的测定

采用改良的Smirnoff水杨酸法，即利用H2O2与 Fe2+反应产生羟自由基，即：H2O2+Fe2+→·OH+ H2O+Fe3+，在体系内加入水杨酸捕捉并产生有色物质，该物质在 510 nm处有最大吸收。由图2可看出，在试验浓度范围内，随着浓度的增大，火龙果花中多酚类化合物对羟自由基的清除率上升较快。BHT对羟自由基的清除率有缓慢的升高。当浓度为0.6 mg/mL时，样品溶液清除率与BHT趋近相同，且当浓度为0.7 mg/mL时，样品溶液清除率（69.98%）甚至略高于BHT（清除率为67.63%）。在实验过程中，因Fe2+有较强的还原性，能与许多氧化剂反应，如氯气，氧气等，造成在配置FeSO4溶液过程中部分Fe2+会氧化成Fe3+，容易产生实验误差。实验表明，火龙果花中多酚类化合物对羟自由基具有较强的清除能力。

2.3 对ABTS自由基清除活性的测定

由图3可看出，火龙果花中多酚类化合物对ABTS自由基清除率随着浓度升高而缓慢上升。总体来看，清除作用不强。当浓度为0.8 mg/mL时，样品溶液表现最强清除率为48.77%，弱于阳性对照BHT（清除率为67.88%）。因样品溶液浓度不纯，可能影响其清除率的测定。而样品溶液清除率曲线趋势与BHT相仿，可以看出其对ABTS自由基也有较好的清除能力。

2.4 对超氧阴离子自由基清除活性的测定

结果如图4所示，样品溶液对超氧阴离子自由基的清除率虽然有所升高，但趋势较为缓慢，在浓度为0.4 mg/mL时，样品溶液清除率仅为23.38%，而BHT清除率（58.76%）接近其3倍。在其表现最强清除能力，当浓度为0.8 mg/mL 时，抑制率不到50%，而BHT清除率在浓度范围内一直维持在60%左右。因此，火龙果花对超氧阴离子自由基具有一定的清除作用，但是较弱。

2.5 还原能力的测定

本试验以普鲁士蓝的生成作为检测指标，待测样品将Fe3+铁氰化物还原为Fe2+铁氰化物，反应体系溶液变为不同程度的蓝色，其在700 nm处有特征光吸收，吸光度大小反应待测样品的抗氧化活性。由图5可知，随着样品浓度的增加，吸光值逐渐升高，即铁离子还原能力逐渐升高。在浓度0.7 mg/mL前，样品溶液与BHT还原能力趋势一致，在浓度为0.8 mg/mL时，样品溶液趋势已接近平缓，而BHT依旧呈上升趋势。可能是多酚的溶解性限制了其金属螯合能力的发挥，所以即使样品溶液还原力与浓度存在量效关系，但还原能力一般，弱于阳性对照BHT。

3 结论与讨论

本研究采用体外抗氧化实验模型，研究了火龙果花中多酚类化合物的还原能力、清除·OH、O2-、DPPH·和ABTS·四种自由基的能力以评价其抗氧化性。实验结果表明：火龙果花中的多酚类化合物能够较好地清除DPPH自由基和羟自由基，且与对照试剂BHT清除率大致相同，甚至在个别浓度下可以超过对照溶液BHT。对ABTS自由基与超氧阴离子清除能力较弱，其还原能力一般，弱于阳性对照BHT。总体来看，火龙果花抗氧化能力与浓度呈量效关系，趋势与BHT相同。所以火龙果花中多酚类化合物具有较好的抗氧化活性，可进一步研究开发为抗氧化功能性食品。

研究者发现，用不同方法对同一物质的抗氧化活性测定，结果可能不一致、甚至是自相矛盾的，而且多酚类物质具有酚羟基团既可以成为氢供体又可作为电子供体，使得他们通常拥有不同的抗氧化潜力[16]。因此，本实验采用优化的福林酚法测定火龙果花多酚化合物的含量，分别采用DPPH法、水杨酸法、ABTS测定法、邻苯三酚自氧化法和普鲁士蓝法测定其抗氧化能力，以期获得全面、准确的火龙果花多酚化合物抗氧化活性数据，为火龙果花深度开发利用提供一定的理论参考。

本研究样品溶液均为火龙果花中多酚类化合物的粗提取物，掺杂许多杂质，其中某种物质可能抑制多酚类化合物的抗氧化活性，提取物样品中一些非多酚抗氧化物质的存在，也可能对其抗氧化活性起到协同作用，增强其抗氧化能力。如果提高提取物纯度，是否会产生不同的实验结果或影响。多酚物质与其抗氧化活性之间的具体构效关系，还需要进一步对火龙果花多酚类化合物组分分离、结构鉴定等基础上进行分析。另外，在实验过程中，有些材料试剂会自发反应，产生系统误差，从而影响实验结果。

本研究仅在浓度为0.4～0.8 mg/mL的范围内进行了探讨，并不能代表整个课题。如浓度在0.8 mg/mL以上时，样品溶液对羟自由基的清除能力是否会超过BHT，对超氧阴离子的清除能力是否会越来越接近对比试剂等，希望这些问题能在后续的研究中进一步分析探讨。

参考文献

[1] Mizrahi Y， Nerd A， Nobel P S. Cacti as crops[J]. Horticultural Reviews， 1997： 291-319.

[2] 蔡永强，郑 伟，王 彬.火龙果花营养成分分析[J].西南农业学报，2010，23（1）：283-286.

[3] 刘伟清，胡伟民，苏运琳. 火龙果花加工方法初探[J]. 广东农业科学，2006（6）：58-59.

[4] 夏杏洲，钟日初，郭茵薇. 火龙果花保健饮料的研制[J]. 广州食品工业科技，2004，20（4）：69-71.

[5] 夏杏洲，胡雪琼，谌素华.霸王花（火龙果花）干制工艺的研究[J]. 食品研究与开发，2006，27（6）：80-82.

[6] 陈欣欣，许时婴. 黑莓渣提取物中多酚类化合物抗氧化活性的研究[J]. 食品工业，2007（3）：3-6.

[7] 姜洪芳，石宝俊，程 晶. 凤仙花不同部位乙醇提取物多酚、黄酮含量测定[J]. 中国野生植物资源，2014，33（6）：9-14.

[8] 范金波，蔡茜彤，冯叙桥. 5 种天然多酚类化合物抗氧化活性的比较[J]. 生产与科研经验，2014，40（7）：77-83.

[9] 韩少华，朱靖博，王妍妍. 邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J]. 中国酿造，2009（6）：155-157.

[10] 李巨秀，王柏玉. 福林-酚比色法测定桑椹中总多酚[J]. 食品科学，2009，30（18）：292-295.

[11] 韦献雅，殷丽琴，钟 成.DPPH法评价抗氧化活性研究进展[J]. 食品科学，2014，35（9）：317-322.

[12] Halliwell B， Gutteridge J M， Aruoma O I. The deoxyribose method： a simple“test-tube”assay for determination of rate constants for reactions of hydroxyl radicals[J]. Analytical Biochemistry， 1987， 165（1）： 215-219.

[13] 李本杰，黄茂春，廖艳芳. 霸王花提取物抗氧化和抗菌活性研究[J]. 食品工业科技，2014，35（7）：80-86.

[14] 张晓璐，徐凯宏. 山楂叶总黄酮清除DPPH和超氧阴离子自由基的研究[J]. 林业科技，2008，33（5）：51-54.

[15] 李颖畅，孟宪军. 蓝莓叶黄酮提取物抗氧化活性的研究[J]. 营养学报，2008，30（1）：427-429.

[16] Havsteen B H. The biochemistry and medical significance of the flavonoids[J]. Pharmacology & Therapeutics， 2002， 96（2-3）： 67-202.