A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的原核表达、纯化及鉴定

颜健华 何奇松 蒋家霞 冯淑萍 黄胜斌 韦达有 易春华 许瑞胜 梁晟 熊毅

摘要：【目的】通过原核表达及纯化获得A型口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白VP1，为建立A型FMDV的ELISA诊断方法及开发安全、高效、广谱的新型基因工程疫苗提供技术支持。【方法】以含A型FMDV VP1基因的重组质粒pMD18- T-A-VP1为模板，通过特异性引物扩增A型FMDV的VP1基因，构建表达质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1，然后转入感受态细胞E. coli BL21（DE3）中诱导表达融合蛋白。【结果】诱导表达获得的VP1融合蛋白主要以包涵体形式存在，分别经His·Bind和GST·Bind柱层析纯化，SDS-PAGE分析结果表明融合蛋白纯度较高；Western blotting检测分析发现，VP1融合蛋白能与豚鼠抗A型FMDV阳性血清发生特异性结合，但不与豚鼠抗O型和Asia1型FMDV阳性血清反应。【结论】经原核表达及纯化获得的A型FMDV VP1融合蛋白具有良好的特异性和抗原性，可用于易感动物的免疫及血清抗体筛查。

关键词： A型FMDV；VP1蛋白；原核表达；纯化；鉴定

中图分类号： S852.659.6 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）02-0301-05

0 引言

【研究意义】口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的一种高度接触性A类动物传染病（Sobrino et al.，2001）。FMDV属于小RNA病毒科（Picornaviridae）、口蹄疫病毒属（Aphthovirus），其完整病毒颗粒包括衣壳和RNA两部分，组成病毒粒子衣壳的主要结构蛋白有4种，分别为VP1、VP2、VP3和VP4，其中暴露于病毒粒子表面的VP1结构蛋白不仅是主要抗原位点存在区，还是病毒受体结合区，为诱导机体产生中和抗体的主要成分（Collen et al.，1991）。FMDV可分为O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型和Asia1型等7个血清型，不同血清型间无交叉免疫反应（Pereira，1977；Domingo et al.，2003）。我国的O型、A型及Asia1型呈交替流行趋势，且涉及面广、疫情复杂、破坏性强（刘畅等，2013）。因此，针对当前FMD疫情的复杂性，有必要建立快速、有效、稳定的检测方法，为其诊断和防控提供技术支持。【前人研究进展】A型FMD于1964年从前苏联传入我国新疆地区（刘在新等，1998），但之后并未发生大规模流行；直至2009年在湖北武汉暴发A型FMD，同年在上海、山东、江苏、广西、贵州和新疆6个省（区）也有A型FMD暴发的报道，2010年在韩国也同样出现A型FMD（刘在新等，1998；Bai et al.，2011；Tamura et al.，2011；Abdul-Hamid et al.，2011）。Knowles等（2012）报道，近年来东南亚国家流行的A型FMD是继O型和Asia1型之后再次引起东亚地区的暴发流行。2013年3月广东茂名某猪场出现A型FMD临床发病病例，之后在我国部分地区开始流行。裴仉福等（2004）对牛源A型FMDV结构蛋白VP1基因进行克隆及表达，發现VP1基因在大肠杆菌中能高效表达，且能被A型FMDV阳性血清识别。李菁等（2010）、刘畅等（2013）也研究发现，VP1重组蛋白能够被A型FMDV阳性血清特异性识别，为深入研究结构蛋白VP1在FMDV致病机制中的作用奠定了基础。【本研究切入点】鉴于A型FMD近年来的流行趋势，有必要对A型FMD进行深入研究，制备出针对VP1单克隆抗体的诊断试剂盒，为有效防控A型FMD提供参考依据。【拟解决的关键问题】通过原核表达及纯化获得A型FMDV结构蛋白VP1，并鉴定其特异性，以期为建立A型FMD的ELISA诊断方法及开发安全、高效、广谱的新型基因工程疫苗提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

原核表达载体pET-32a、pGEX-6p-1及含A型FMDV VP1基因的重组质粒pMD18-T-A-VP1由广西动物疫病预防控制中心保存提供；T4 DNA连接酶、限制性内切酶、Ex Taq DNA聚合酶、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒等购自宝生物工程（大连）有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗豚鼠IgG抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，豚鼠抗A型FMDV阳性血清购自中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所。

1. 2 引物设计与合成

根据原核表达载体及目的基因序列设计1对针对完整VP1基因（639 bp）的特异性引物E1（5'-CCG

GAATTCACCACCACTGTTGAGAACTACG-3'）和E2

（5'-CCGCTCGAGTCATTACAGGAGTTGCTTTGCA

GGTGC-3'），并插入EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点（下划线部分）。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1. 3 VP1重组表达载体的构建

以测序正确的重组质粒pMD18-T-A-VP1为模板，用引物E2/E3扩增VP1基因，回收其目的基因。用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，同时双酶切处理原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1，将目的基因酶切回收产物与表达载体酶切回收产物进行连接、转化感受态细胞E. coli BL21（DE3），提取重组质粒后，分别对阳性重组质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1进行鉴定。

1. 4 VP1重组菌的诱导表达

对阳性重组质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1的菌液进行复苏，于37 ℃下摇床（200 r/min）培养过夜。然后分别取复苏菌液500 μL加入到两管含10 mL氨苄西林（Amp）的LB培养液中，37 ℃下斜摇（200 r/min）培养，待菌液OD值达0.4～0.6时，其中一管加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导菌液表达蛋白，另外一管不加IPTG作空白对照，于37 ℃下继续直摇（200 r/min）培养4～6 h，以SDS-PAGE和Western blotting检测重组菌蛋白的表达情况。

1. 5 VP1重组菌表达形式的确定

取诱导表达后的菌液30 mL，10000×g离心10 min，弃上清液；用PBS洗涤重组菌沉淀，重复洗涤3次；加入20 mL PBS重悬重组菌沉淀，反复冻融3次后，在冰浴中超声波裂解（先超声波裂解3 s，间歇5 s振幅30%，再超声波裂解30 min）；经10000×g离心10 min后分别收集沉淀和上清液，并以SDS-PAGE分析重组菌表达蛋白形式。若表达蛋白存在于上清液中，即为可溶性蛋白；存在于沉淀中，则为包涵体形式。

1. 6 VP1融合蛋白的纯化

利用His·Bind柱层析纯化法对融合蛋白pET-32a- VP1进行纯化，以GST·Bind柱层析纯化法对融合蛋白pGEX-6p-1-VP1进行纯化，最后采用SDS-PAGE分析目的蛋白的纯化情况。

1. 7 纯化融合蛋白鉴定

采用Western blotting对纯化的融合蛋白进行鉴定，其一抗分别使用豚鼠抗A型、O型和Asia1型FMDV阳性血清，酶标二抗使用山羊抗豚鼠血清IgG-HRP。

2 结果与分析

2. 1 VP1重组表达载体

以重组质粒pMD18-T-A-VP1为模板，用特异性引物E2/E3扩增得到的VP1基因大小为639 bp，与预期结果一致（图1）。将该目的片段克隆至pET-32a和pGEX-6p-1原核表达载体后，经PCR及双酶切鉴定，结果显示目的片段与预期结果一致（图2）；测序分析结果显示重组质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1均含有编码正确的读码框（图3）。

Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant bacteria E. coli BL21

M：标准蛋白质分子量；1：诱导的pET-32a-VP1/BL21；2：未诱导的pET- 32a-VP1/BL21；3：诱导的pET-32a/BL21；4：未诱导的pET-32a/BL21；5：诱导的pGEX-6P-1-VP1/BL21；6：未诱导的pGEX-6P-1-VP1/BL21；7：诱导的pGEX-6P-1/BL21；8：未诱导的pGEX-6P-1/BL21

M：Protein molecular weight marker；1：Induced pET-32a-VP1/BL21；2： Non-induced pET-32a-VP1/BL21； 3： Induced pET-32a/BL21； 4： Non-induced pET-32a/BL21； 5： Induced pGEX-6P-1-VP1/BL21； 6： Non-induced pGEX-6P-1-VP1/BL21； 7： Induced pGEX-6p-1/BL21； 8： Non- induced pGEX-6P-1/BL21

2. 2 VP1重组菌的融合表达及纯化结果

对重组菌pET-32a-VP1/BL21和pGEX-6p-1-VP1/ BL21的裂解产物进行SDS-PAGE分析，再用考马斯亮蓝快速染色剂进行染色，结果观察到重组菌的裂解产物分别在43.6和49.3 kD附近出現特异的蛋白条带（图4），与预期结果一致，而未经诱导的菌液没有呈现出对应的蛋白条带。

2. 3 VP1融合蛋白的可溶性分析结果

诱导表达的重组菌pET-32a-VP1/BL21和pGEX- 6p-1-VP1/BL21经超声波裂解后，分别取其上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析，结果发现融合蛋白主要以包涵体的形式存在于菌体中（图5）。

2. 4 VP1融合蛋白的纯化结果

融合蛋白包涵体经柱层析纯化复性后，进行SDS-PAGE分析，结果发现获得的目的蛋白条带大小与预期结果一直，且条带较清晰、单一（图6），说明融合蛋白纯化效果较好。

2. 5 VP1融合蛋白的Western blotting检测分析结果

对纯化复性的融合蛋白pET-32a-VP1和pGEX-6p- 1-VP1进行Western blotting检测分析，发现在目的蛋白大小处出现特异性反应条带（图7），说明表达的VP1融合蛋白能与豚鼠抗A型FMDV阳性血清发生特异性结合，但不与豚鼠抗O型和Asia1型FMDV阳性血清反应，即VP1融合蛋白具有相对特异的生物活性。

3 讨论

完整的蛋白原核表达系统一般包括配套的表达菌株和表达载体，虽然原核表达存在蛋白翻译后加工修饰不完善以致表达产物生物活性相对较低的缺点，但因其周期短、蛋白表达量大、成本低，表达菌株和表达载体选择性多、背景清楚，且表达载体带标签有利于表达菌株的筛选和蛋白纯化等优点，已成为目前最成熟的体外蛋白表达系统（郭广君等，2006）。pET和pGEX系统是常见的表达系统，其表达融合蛋白功能强大、基础表达水平低、融合蛋白可根据相应的标签蛋白进行层析纯化（李玮东等，1999）。因此，本研究选用pET-32a和pGEX-6p-1两种表达载体来表达A型FMDV的VP1蛋白。

本研究结果表明，VP1融合蛋白的表达形式主要为包涵体，预试验曾尝试通过改变诱导条件包括温度、转速、诱导时间及IPTG浓度使其表达形式转变为可溶性，以简化目的蛋白的纯化，提高蛋白免疫原性，但发现VP1融合蛋白表达形式依然以包涵体为主，可溶性蛋白量很小，与王海烽等（2009）的研究结果一致。有关原核表达蛋白以包涵体形式表达的研究主要存在以下几个观点：（1）重组蛋白硫氨酸、脯氨酸含量较高；（2）蛋白表达速度快，肽链没有足够时间完成正常折叠；（3）表达蛋白浓度高，折叠中间体的溶解度有限；（4）表达系统缺少转录后的修饰和分子伴侣（Palmer and Wingfield，2012）。有报道称，包涵体蛋白不需要结构和构象的修饰即可进行可逆性变性或复性（Tsumoto et al.，2003），并已证实包涵体通过化学解离能重折叠为有活性的蛋白（Seckler and Jaenicke，1992）。因此，VP1蛋白在原核表达系统中的高效表达，包涵体形式的存在不可避免，为获得具有特异性和生物活性的重组蛋白，须进一步加强包涵体蛋白的纯化与复性研究。

蛋白纯化方式多样，主要有盐析、超滤、离子交换层析及亲和层析等。常惠芸等（2009）利用His标签蛋白亲和层析法纯化得到纯度较高的C型FMDV VP1蛋白；宋英莉等（2012）利用离子交换层析法获得纯度较高的HtsA蛋白。本研究分别根据融合表达载体上的His和GST标签蛋白进行亲和层析纯化，得到的融合蛋白纯度较高，同时使用尿素对包涵体蛋白进行变性及透析复性，并在配制的复性缓冲液中加入促进二硫键形成的还原型/氧化型谷胱甘肽及促进天然构象形成和抑制聚集的L-精氨酸、甘油、Tris等试剂，蛋白复性取得良好效果。经Western blotting检测分析，发现VP1融合蛋白可与豚鼠抗A型FMDV阳性血清发生特异性结合，但不与豚鼠抗O型和Asia1型FMDV阳性血清反应，说明目的蛋白具有良好的特异性和抗原性，加之纯度较高，完全可用于易感动物的免疫及血清抗体筛查，为防控A型FMD奠定基础。

4 结论

经原核表达及纯化获得的A型FMDV VP1融合蛋白具有良好的特异性和抗原性，可用于易感动物的免疫及血清抗体筛查。

参考文献：

常惠芸，独军政，丛国正，邵军军，林彤，冯金瑞，刘萍. 2009. C型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及重组蛋白的纯化[J]. 畜牧与兽医，41（7）：4-7.

Chang H Y，Du J Z，Cong G Z，Shao J J，Lin T，Feng J R，Liu P. 2009. Prokaryotic expression of VP1 gene of foot-and-mouth disease virus serotype C and purification of recombinant protein[J]. Animal Husbandry and Veterinary Medicine，41（7）：4-7.

郭广君，吕素芳，王荣富. 2006. 外源基因表达系统的研究进展[J]. 科学技术与工程，6（5）：582-587.

Guo G J，Lü S F，Wang R F. 2006. Progress on the expression system of heterologous gene[J]. Science Technology and Engineering，6（5）：582-587.

李菁，林彤，高闪电，丛国正，独军政，邵军军，常惠芸. 2010. A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达、纯化及活性检测[J]. 安徽农业科学，38（10）：5248-5250.

Li J，Lin T，Gao S D，Cong G Z，Du J Z，Shao J J，Chang H Y. 2010. Expressin，purification and activity detection of VP1 of A-type FMDV[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，38（10）：5248-5250.

李玮东，梁布锋，祁自柏. 1999. pGEX-L系列表达载体的构建[J]. 微生物学免疫学进展，27（1）：19-21.

Li W D，Liang B F，Qi Z B. 1999. Construction of the pGEX-L series expression vectors[J]. Progress in Microbiology and Immunology，27（1）：19-21.

刘畅，卢清侠，杨继飞，王世红，王寅彪，郭官鹏，邓瑞广，张改平. 2013. A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测[J]. 西北农业学报，22（9）：7-12.

Liu C，Lu Q X，Yang J F，Wang S H，Wang Y B，Guo G P，Deng R G，Zhang G P. 2013. Prokaryotic expression and activity analysis of VP1 of foot-and-mouth disease virus serotype A[J]. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，22（9）：7-12.

刘在新，赵启祖，刘卫，周鹏程，朱彩珠，常慧芸，谢庆阁. 1998. 6株A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1（1D）基因的核苷酸序列分析[J]. 病毒学报，14（1）：60-67.

Liu Z X，Zhao Q Z，Liu W，Zhou P C，Zhu C Z，Chang H Y，Xie Q G. 1998. Analysis of VP1-coding nucleotide sequences of six strains of foot-and-mouth disease virus type A[J]. Chinese Journal of Virology，14（1）：60-67.

裴仉福. 2004. A型口蹄疫病毒結构蛋白VP1基因的克隆及其在E. coli中的表达[D]. 兰州：甘肃农业大学.

Pei Z F. 2004. Cloning of structural protein VP1 of foot-and-mouth disease virus A and expression in E. coli[D]. Lanzhou：Gansu Agricultural University.

宋英莉，吕春梅，张晓兰，边淑玲，徐杰，朱宛宛，朱辉. 2012. HtsA表达质粒克隆和蛋白质的纯化[J]. 哈尔滨医科大学学报，46（4）：320-328.

Song Y L，Lü C M，Zhang X L，Bian S L，Xu J，Zhu W W，Zhu H. 2012. Contruction of recombinant plasmid pET21d-HtsA and expression and purification of HtsA protein[J]. Journal of Harbin Medical University，46（4）：320-328.

王海烽，易忠，魏玉荣，魏婕，胡尔马西，符子华. 2009. 口蹄疫病毒VP1基因的原核可溶性表达[J]. 中国畜牧兽医，36（10）：50-54.

Wang H F，Yi Z，Wei Y R，Wei J，Huermaxi，Fu Z H. 2009. The exploration of prokaryotic soluble expression of foot and mouth disease virus VP1 gene[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，36（10）：50-54.

Abdul-Hamid N F，Hussein N M，Wadsworth J，Radford A D，Knowles N J，King D P. 2011. Phylogeography of foot-and-mouth disease virus types O and A in Malaysia and surrounding countries[J]. Infection，Genetics and Evolution，11（2）：320-328.

Bai X W，Li P H，Bao H F，Liu Z X，Li D，Lu Z J，Cao Y M，Shang Y J，Shao J J，Chang H Y，Luo J X，Liu X T. 2011. Evolution and molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus in China[J]. Chinese Science Bulletin，56（21）：2191-2201.

Collen T，Dimarchi R，Doel T R. 1991. A T cell epitope in VP1 of food-and-mouth disease virus is immunodominant for vaccinated cattle[J]. Journal of Immunology，146（2）：749-755.

Domingo E，Escarmis C，Baranowski E，Ruiz-Jarabo C M，Carrillo E，Nunez J I，Sobrino F. 2003. Evolution of foot-and-mouth disease virus[J]. Virus Research，91（1）：47-63.

Knowles N J，He J，Shang Y，Wadsworth J，Valdazo-González B，Onosato H，Fukai K，Yoshida K，Cho I S，Kim S M，Park J H，Lee K N，Luk G，Borisov V，Scherbakov A，Timina A，Bold D，Nquyen T，Paton D J，Hammond J M，Liu X，King D P. 2012. Southeast Asian foot-and-mouth disease viruses in Eastern Asia[J]. Emerging Infectious Diseases，18（3）：499-501.

Palmer I，Wingfield P T. 2012. Preparation and extraction of insoluble（inclusion-body） proteins from Escherichia coli[J]. Current Protocols in Protrin Science，6：1-24.

Pereira H G. 1977. Subtyping of foot and mouth disease virus[J]. Developments in Biological Standardization，35：167-174.

Seckler R，Jaenicke R. 1992. Protein folding and protein refol-

ding[J]. FASEB Journal，6（8）：2545-2552.

Sobrino F，Sáiz M，Jiménez-Clavero MA，Núnez J I，Rosas M F，Baranowski E，Lev V. 2001. Foot and-mouth disease virus：a long known virus，but a current threat[J]. Veterinary Research，32（1）：1-30.

Tamura K，Peterson D，Peterson N，Stecher G，Nei M，Kumar S. 2011. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biolody and Evolution，28（10）：2731-2739.

Tsumoto K， Ejima D， Kumagai I， Arakawa T. 2003. Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies[J]. Protein Expression and Purification，28（1）：1-8.

（責任编辑 兰宗宝）