木薯/花生间作对其根际土壤微生物数量、群落结构及多样性的影响

徐海强 黄洁 刘子凡 魏云霞 苏必孟 李天

摘要：【目的】研究木薯或花生单作与木薯/花生间作对木薯和花生根际土壤细菌、真菌数量与群落结构及多样性的影响，为从根际微生态角度阐释木薯与花生的地下部互作机制提供科学依据。【方法】设木薯单作、花生单作和木薯/花生间作3个处理，采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）分别测定单作与间作的根际土壤细菌和真菌数量，并通过变性梯度凝胶电泳（DGGE）进行细菌和真菌群落结构及多样性分析。【结果】不论单作或间作，木薯和花生根际土壤细菌、真菌数量均随着生育期的延长呈先增长后下降的变化趋势，在木薯块根形成期和花生结荚期达到峰值。木薯/花生间作后期根际土壤细菌与真菌数量的比值（B/F）提高，有利于木薯和花生的根际土壤向细菌型转化，且间作木薯根际土壤B/F比间作花生分别提高了1.02和1.25倍。在木薯块根形成期和花生结荚期，与单作相比，间作的DGGE图谱特异条带数有所改变，多样性指数有所降低，但与单作多样性指数差异不明显。【结论】木薯/花生间作有利于木薯和花生根际土壤向高肥力的细菌型转化，且间作同时可改变木薯和花生根际土壤细菌和真菌的群落结构，但对其多样性影响不明显。

关键词： 木薯；花生；间作；根际土壤；细菌；真菌

中图分类号： S344.2；S154.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）02-0185-06

0 引言

【研究意义】微生物是土壤生态系统的重要组成之一，对有机质分解、养分循环及利用、生态系统的稳定性和可持续性起着重要作用（贾志红等，2004）。有研究指出，根际土壤微生物群落的组成和变化对调节土壤肥力有重要影响（贾志红等，2004；曹均等，2010），而土壤肥力又直接影响作物的生产力。木薯是我国热带亚热带地区的重要能源和淀粉作物，因其生育期较长，行距较宽，适宜与生育期较短且植株矮小的花生进行间套作种植（韩全辉等，2014）。木薯/花生间作模式已成为我国热带亚热带地区特有的间作搭配模式（韩全辉等，2014），该模式可充分利用现有土地资源并增加农民的经济收益（唐秀梅等，2015）。因此，研究木薯/花生间作对根际微生物数量、群落结构和多样性的影响，对促进木薯种植及其产业发展具有重要意义。【前人研究进展】国内关于间作模式的研究正在从地下部营养吸收（漆智平等，1999）、叶片光合生理（唐秀梅等，2011；韩全辉等，2014）、模式搭配和产量效益（徐小林等，2012）等向根际土壤微生态方面转移（宋亚娜等，2006；何国艳等，2012；沈雪峰等，2014；唐秀梅等，2015）。宋亚娜等（2006）研究表明，小麦/蚕豆、玉米/蚕豆和小麦/玉米间作模式能改变土壤微生物群落组成，提高作物根际细菌群落多样性，表现出不同程度的产量优势；沈雪峰等（2014）研究发现，甘蔗/花生间作能显著提高甘蔗和花生根际土壤细菌和真菌数量，改良土壤微生物状况；唐秀梅等（2015）在研究木薯/花生间作对土壤微生态的影响时发现，间作能增加木薯和花生根际土壤细菌和真菌数量及微生物多样性。【本研究切入点】目前，有关木薯/花生间作对不同生育期木薯和花生根际土壤微生物数量、群落结构及多样性影响的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）和变性梯度凝胶电泳（DGGE），研究木薯单作、花生单作、木薯/花生间作对木薯和花生根际土壤细菌、真菌数量与群落结构及多样性的影响，为从根际微生态角度阐释木薯与花生的地下部互作机制提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 供试材料

供试木薯品种为华南8号，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所选育提供；花生品种为贺油12，由广西贺州市农业科学研究所提供。

1. 2 试验方法

试验于2014年3～7月在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所木薯试验基地进行。前茬作物为木薯。0～20 cm土层基本理化性质：pH 5.19，有机质含量0.97%，碱解氮含量48.08 mg/kg，速效磷含量24.72 mg/kg，速效钾含量62.87 mg/kg，细菌含量2.5×108 CFU/g，真菌含量0.69×106 CFU/g。

1. 2. 1 试验设计 试验设木薯单作、花生单作和木薯/花生间作3个处理，随机区组排列，3次重复，共9个小区，每小区面积30.8 m2（5.5 m×5.6 m）。木薯株行距为0.8 m×1.1 m，花生株行距为0.2 m×0.3 m。间作小区中在2行木薯行中间种植2行花生，木薯行与花生行的距离均为0.4 m。2014年3月25日种植木薯和花生，东西行向种植，木薯种茎芽眼朝东。本试验不施肥料，田间管理一致。

1. 2. 2 取样 分别于5月15日（木薯苗期、花生花针期）、6月15日（木薯块根形成期、花生结荚期）和7月15日（木薯块根膨大期、花生成熟期）在各小区内沿东往西行向取根际土壤样品。取样时，不取边列效应的第1、3、5、7列木薯，按次序取第2、4、6列木薯；在同一列中，排除两侧边行的各1株木薯，每次只取各列中间的3株木薯及与取样木薯对应的最近1株花生。将整株木薯和花生挖出，轻抖根系，用毛刷将根际土轻轻刷下，得到根际土壤样品；分别将每小区中的3株木薯和3株花生的根际土壤各混合为一个样品。在单作系统中，木薯根际土壤用MC（Monocropping cassava）表示，单作花生根际土壤用MP（Monocropping peanut）表示；在间作系统中，木薯根际土壤用IC（Intercropping cassava）表示，花生根际土壤用IP（Intercropping peanut）表示。对土壤样品迅速过筛除去杂物，-80 ℃保存，用于基因组DNA的提取。

1. 3 測定项目及方法

1. 3. 1 土壤样品细菌、真菌数量的测定 每份土壤样品称取0.3 g，按照美国MoBio的土壤提取试剂盒说明提取土壤样品中微生物总DNA，于-20 ℃保存备用。利用Real-time PCR测定根际土壤样品中细菌、真菌数量（Fierer et al.， 2005）。用含大肠杆菌16S全长和酿酒酵母18S全长的质粒为标准品，稀释成不同梯度后，用Real-time PCR绘制成标准曲线。细菌、真菌定量扩增引物见表1，分别为Eub338/Eub518、5.8S/ITS1f。根据所得样品Cq值，计算每克土壤所含微生物数量。

1. 3. 2 土壤微生物群落结构和多样性分析

1. 3. 2. 1 PCR扩增 采用细菌PCR扩增的通用引物Eub338/Eub518和真菌PCR扩增的18S rDNA通用引物NS1/Fungi（沈宗专等，2015）（表1）。PCR反应体系50 μL：1 μL模板DNA，25 μL Premix，上、下游引物各1 μL，22 μL ddH2O。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，细菌59.0 ℃（真菌56.4 ℃） 45 s，72 ℃ 300 s，进行30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1. 3. 2. 2 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 采用D-Code基因突变检测系统对PCR产物进行DGGE分析。聚丙烯酰胺凝胶浓度8%，细菌变性剂浓度40%～60%，真菌变性剂浓度20%～40%。电泳条件：在80 V电压下，60 ℃电泳14 h，电泳结束后进行银染并拍照。Shannon-

Wiener指数是目前应用最广泛的可以反映土壤微生物群落结构多样性的指数之一（Larkin， 2003），因此，采用Shannon多样性指数（H）表征土壤微生物群落多样性。

H=-ΣPi lnPi

式中，Pi=ni /N，ni是第i条条带的多度，N为样品中所有条带的总多度。

1. 4 统计分析

采用Excel 2007和SAS 9.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2. 1 木薯/花生间作对木薯根际土壤细菌和真菌数量的影响

由表2可看出，在木薯生育期内，不论单作或间作，木薯根际土壤细菌和真菌数量均随生育期的延长呈先增长后下降的变化趋势，在木薯块根形成期达到峰值，且块根形成期的细菌和真菌数量均显著高于苗期和块根膨大期（P<0.05，下同）。间作与单作相比，木薯块根膨大期间作的木薯根际土壤细菌数量比单作提高了59.4%；木薯块根形成期和膨大期间作的木薯根际土壤真菌数量分别比单作降低了33.8%和10.0%。从细菌与真菌数量的比值（B/F）来看，木薯苗期间作的木薯根际土壤B/F低于单作12.9%，但在木薯块根形成期和膨大期，间作的木薯根际土壤B/F分别比单作高25.0%和66.4%。由此可见，在木薯与花生的共生期内，木薯/花生间作有利于木薯根际土壤向细菌型转化。

2. 3 木薯/花生间作对其根际土壤细菌群落结构和多样性的影响

在木薯块根形成期及花生结荚期，单作或间作对木薯和花生根际土壤细菌群落结构的影响如图1所示。不论单作或间作，木薯和花生样品的整条泳道含有条带数为12～14条；与木薯单作（MC）相比，木薯间作（IC）消失了条带1，增加了条带2，且条带3和4亮度增加，条带5亮度减弱；与花生单作（MP）相比，花生间作（IP）消失了条带6、8和9，增加了条带7和10。由此可见，在木薯块根形成期及花生结荚期，木薯/花生间作明显改变了木薯和花生根际土壤细菌群落结构。

对图1中的条带进行Shannon-Wiener指数分析，结果显示，分别与木薯单作（MC）和花生单作（MP）相比，木薯间作（IC）和花生间作（IP）的根际土壤细菌H分别降低了5.6%和5.7%。由此可见，在木薯块根形成期及花生结荚期，与单作相比，木薯/花生间作使木薯和花生根际土壤细菌多样性指数有所降低，但与单作多样性指数差异不明显。

2. 4 木薯/花生间作对根际土壤真菌群落结构和多样性的影响

在木薯块根形成期及花生结荚期，单作或间作对木薯和花生的根际土壤真菌群落结构的影响如图2所示。不论单作或间作，木薯和花生样品的整条泳道含有条带数为10～15条；与木薯单作（MC）相比，木薯间作（IC）消失了条带4，增加了条带3、5和6，条带1和2亮度减弱；与花生单作（MP）相比，花生间作（IP）消失了条带7、8、9和10。说明在木薯块根形成期及花生结荚期，木薯/花生间作明显改变了木薯和花生根际土壤真菌群落结构。

对图2中的条带进行Shannon-Wiener指数分析，结果显示，与木薯单作（MC）和花生单作（MP）相比，木薯间作（IC）和花生间作（IP）的根际土壤真菌H分别降低了2.9%和16.7%。由此可见，在木薯块根形成期及花生结荚期，与单作相比，木薯/花生间作使木薯和花生根际土壤真菌多样性指数有所降低，但与单作多样性指数差异不明显。

3 讨论

3. 1 间作对根际土壤细菌和真菌数量的影响

本研究结果表明，不论单作或间作，木薯和花生的根际土壤细菌、真菌数量均随着生育期的延长呈先增长后下降的变化趋势，在木薯块根形成期和花生结荚期达到峰值。木薯块根形成期是木薯块根快速发育形成的关键时期，花生结荚期是花生根系生长最旺盛的时期，说明木薯和花生的根际微生物数量与其根部发育情况密切相关，块根或根系生长旺盛时，其根际微生物数量相应增加。相关研究表明，甜菜（张亚平和刘日明，1999）、棉花（张凤华等，2000）和黄瓜（胡元森等，2004）的根际微生物数量与相应生育期的根系生长呈正相关，与本研究结果基本一致。B/F是土壤向细菌型转化和肥力提高的一个生物学标志（李瓊芳，2006）。本研究结果表明，与木薯或花生单作相比，木薯/花生间作中后期可提高木薯和花生根际土壤B/F，说明木薯/花生间作后期细菌数量增加、真菌数量降低，有利于木薯和花生根际土壤向高肥力的细菌型转化，与西瓜/大豆、辣椒/甜瓜等间作模式能提高B/F，从而使作物土壤向高肥力细菌型转化的结论相似（张娟，2014）。另外，在木薯块根形成期（花生结荚期）和膨大期（花生成熟期），间作木薯根际土壤B/F比间作花生分别提高了1.02和1.25倍，说明在木薯/花生间作模式中，木薯比花生更有利于其根际土壤向高肥力的细菌型转化。

3. 2 间作对根际土壤细菌和真菌群落结构及多样性的影响

DGGE条带的多寡和亮度反映了土壤中微生物种群的类别和数量。本研究的DGGE分析结果表明，在木薯块根形成期和花生结荚期，间作与单作相比，特异条带数有所改变，说明间作明显改变了木薯和花生根际土壤的细菌和真菌群落结构，这些类群的微生物有可能对木薯和花生的生长起特殊作用，如将差别条带进行分离、测序和菌种鉴定，将有助于木薯根际微生态、微生物肥料和木薯/花生间作机制等研究工作的开展。

在本研究中的木薯块根形成期及花生结荚期，与单作相比，木薯/花生间作对木薯和花生根际土壤细菌和真菌多样性指数有所降低，但与单作多样性指数差异不明显，与小麦/蚕豆间作能够稳定中期作物的根际细菌群落多样性结果近似（宋亚娜等，2006），但不同于小麦/蚕豆间作的中后期能显著降低蚕豆根际微生物多样性的结果（董艳等，2008）。可能是由于董艳等（2008）采用的是传统可培养方法，仅反映土壤中0.1%～1.0%的微生物（罗海峰等，2003），而本研究和宋亚娜等（2006）采用的是以PCR为基础的现代分子生物学方法，能反映土壤中100%的微生物（陈灏等，2002）。由此可见，本研究中的木薯和花生根际土壤细菌和真菌群落多样性结果可靠。

4 结论

本研究结果表明，与木薯或花生单作相比，木薯/花生间作后期有利于作物根际土壤向高肥力的细菌型转化，且间作同时可改变木薯和花生根际土壤细菌和真菌的群落结构，但对其多样性影响不明顯。

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（责任编辑 王 晖）