雌雄全蝎中蛋白质及多糖含量的测定与比较

程晓荟　吴瑶瑶　赵延慧　王新东　朱晓静

摘要：分别采用考马斯亮蓝法和苯酚-硫酸法测定雌雄全蝎中蛋白质及多糖的含量，研究雌雄全蝎中蛋白质及多糖的含量差异。结果表明：雄蝎中蛋白质和多糖含量分别为83.9 mg/g和3.21 mg/g，雌蝎中蛋白质和多糖含量分别为68.3 mg/g和4.45 mg/g，雄蝎中含有较多的蛋白质，而雌蝎中含有较多的多糖。雌蝎、雄蝎中所含蛋白质及多糖的含量存在差异，预测其药效作用也应有一定区别。

关键词：全蝎；蛋白质；多糖；含量测定；雌雄差异

中图分类号：S865.4⁺9 文献标识号：A 文章编号：1001—4942（2016）03—0130—03

中药材全蝎Scorpion，为钳蝎科动物东亚钳蝎Buthus martensii Karsch的干燥体。全蝎味辛、性平、有毒、归肝经，具有息风镇痉、通络止痛、攻毒散结的功效。该药被用于药方配伍，在中成药中也有较为广泛的应用。全蝎含有蝎毒、三甲胺、甜菜碱、硫磺酸、棕榈酸、软硬脂酸、胆甾醇及铵盐、卵磷脂等，其中蝎毒为主要有效成分，主要由蛋白质和非蛋白质两部分组成。蝎毒的蛋白质成分主要是一类含有20～80个氨基酸的小分子多肽（通称为蝎毒素），此外尚含有微量元素钙、镁、铁、铜、锌等。近年研究发现，蝎毒中的活性蛋白质在镇痛、抗凝、抗癫痫等方面有效，不仅可直接杀伤或抑制肿瘤细胞，还能提高机体自身的免疫功能。多糖所具有的抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性也相继被发现。因此，全蝎蛋白质、多糖的含量与其药效有着一定关系。

全蝎在实际配伍使用中不区分雌雄，因此对于全蝎中蛋白质及多糖的含量测定并未加以区分。本试验分别测定雌蝎、雄蝎中蛋白质及多糖的含量，探讨研究雌、雄全蝎问是否存在差异，以期为全蝎的使用及进一步研究提供参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

市售7龄活雌蝎及雄蝎，经山东中医药大学生药系李峰教授鉴定为东亚钳蝎。

冷冻干燥机（LGJ-18A，北京四环科学仪器厂有限公司）；超声波清洗器（KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司）；台式离心机（TDL80-2B，上海安亭科学仪器厂）；紫外一可见分光光度计（UV 9100B，北京莱伯泰科仪器有限公司）；真空干燥箱[DZF-3（6020B），上海福玛实验设备有限公司]。

牛血清蛋白（BSA，国药集团化学试剂有限公司）；D-无水葡萄糖（中国药品生物制品检定所）；苯酚（天津市秋竹科技开发有限公司）；浓硫酸（莱阳经济技术开发区精细化工厂）；石油醚、三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）。化学试剂均为分析纯，试验用水为蒸馏水。

1.2试验方法

1.2.1全蝎蛋白质及多糖供试品的制备①全蝎冻干粉的制备：将活雌蝎、雄蝎于冷冻干燥箱中冷冻12 h，再分别用高速万能粉碎机粉碎，经冷冻干燥机干燥，得雌蝎、雄蝎冻干粉置冰箱备用。

②全蝎蛋白质供试液的制备：分别精密称取雌蝎、雄蝎冻干粉各2.0 g于锥形瓶中，每次加60mL蒸馏水超声10 min，共超声3次，分别得雌蝎、雄蝎蛋白质供试品溶液。

③全蝎多糖供试液的制备：精密称取雄蝎冻干粉2.0 g，置索氏提取器中，加入100 mL石油醚，加热回流提取4 h进行脱脂处理，弃去石油醚，挥干，药渣置具塞三角瓶中加入60 mL蒸馏水，超声提取30 min，再置90℃水浴中浸提3 h，将提取液离心抽滤，收集滤液，将滤液浓缩至约5mL，加入等体积的sevage液（氯仿：正丁醇=4：1）。振荡、离心，取水层，再加入等体积的sevage液，重复操作5次以除净蛋白。取水层加入4倍体积的无水乙醇，静置过夜，离心，沉淀用少量无水乙醇洗涤4次，得到沉淀，将沉淀置真空干燥器40℃干燥4 h，得雄蝎多糖粉末。取多糖粉末约5 mg，精密称定，加水溶解，定容于10 mL量瓶中，即得雄蝎多糖供试品溶液。

按相同方法制备雌蝎多糖供试品溶液。1.2.2雌蝎、雄蝎中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。精密称取牛血清蛋白50 mg，加水溶解，置250 mL容量瓶中定容至刻度，摇匀，即得牛血清蛋白对照品溶液（0.2mg/mL）。

精密吸取对照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分别置10 mL具塞试管中，各补加蒸馏水至1.0 mL，然后各加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0 mL，摇匀，放置5 min。在595 nm波长处，以第一份溶液为空白，分别测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

精密吸取雌、雄蝎蛋白质供试液各0.1 mL，分别置10 mL具塞试管中，照上述标准曲线测定方法进行供试品溶液吸光度的测定，按回归方程计算蛋白质含量。

1.2.3雌蝎、雄蝎中多糖含量的测定 采用苯酚一硫酸法测定多糖含量。精密称取105%干燥至恒重的无水葡萄糖25 mg，加水溶解，置250 mL容量瓶中定容至刻度，摇匀，即得葡萄糖对照品溶液（0.1 mg/mL）。

精密吸取葡萄糖对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置10 mL具塞试管中，加水补至1.0 mL，后分别加入5%的苯酚溶液1.0mL，混匀。迅速加入浓硫酸5.0 mL，混匀，室温静置20 min。在490 nm波长处，以第一份溶液为空白，测定葡萄糖对照品溶液的吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

精密吸取雌蝎、雄蝎多糖供试液各1.0 mL，分别置10 mL具塞试管中，照上述标准曲线测定方法进行供试品溶液吸光度的测定，按回归方程计算多糖含量。

2结果与分析

2.1考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

2.1.1蛋白质含量测定的标准曲线 如图1所示，得回归方程A=37.582C+0.0083（r=0.9989），具有良好的线性关系。

2.1.2精密度试验 精密吸取牛血清蛋白溶液0.5 mL，进行吸光度测定，重复6次，计算得RSD为0.59%，表明仪器精密度良好。

2.1.3稳定性试验 精密吸取蛋白质供试品溶液1.0 mL，分别于0、15、30、45、60 min测定吸光度，计算RSD为1.21%，表明供试品溶液在1 h内稳定性好。

2.1.4重复性试验 精密吸取蛋白质供试品溶液1.0 mL共6份，进行吸光度测定，计算RSD为2.01%，表明方法重复性较好。

2.1.5加样回收试验 精密吸取已知含量的全蝎蛋白质供试品溶液0.05 mL共6份，分别精密加入牛血清蛋白溶液0.2 mL，测定吸光度，计算加样回收率。所测平均回收率为102.4%，RSD为1.82%，加样回收率符合要求。

2.1.6雌蝎、雄蝎中蛋白质的含量 按标准曲线法计算供试品中蛋白质含量，所测雌蝎中蛋白质含量为68.3 mg/g，而雄蝎中为83.9 mg/g。结果显示，雄蝎较雌蝎含有较多的蛋白质，这与全蝎常规使用中认为雄蝎的药用价值更高相一致。

2.2苯酚-硫酸法测定多糖的含量

2.2.1多糖含量测定的标准曲线如图2所示，得回归方程为：A=69.077C+0.0222，相关系数r=0.9993，具有良好的线性关系。

2.2.2精密度试验 精密吸取葡萄糖对照品溶液0.4 mL，进行吸光度测定，重复6次，计算得RSD为0.98%，表明仪器精密度良好。

2.2.3稳定性试验 精密吸取全蝎多糖供试品溶液1.0 mL，分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h测定吸光度，计算RSD为1.71%，表明供试品溶液在3 h内稳定性好。

2.2.4重复性试验 取同一全蝎多糖粉末6份，照1.2.1及1.2.3方法制备供试品溶液及测定吸光度，计算RSD为1.66%，结果表明供试品测定符合技术要求，重复性良好。

2.2.5加样回收试验 精密吸取已知含量的全蝎多糖供试品溶液0.5 mL共6份，分别精密加入葡萄糖对照品溶液0.3 mL，测定吸光度，计算加样回收率。所测平均回收率为98.65%，RSD为1.42%，加样回收率符合要求。

2.2.6雌蝎、雄蝎中多糖的含量 按标准曲线法计算供试品中多糖含量，所测雌蝎中多糖的含量为4.45 mg/g，而雄蝎中多糖的含量为3.21 mg/g。结果显示，雌蝎较雄蝎中含有较多的多糖，二者存在一定差异。

3小结与讨论

现代药理学研究证明，全蝎主要活性成分蝎毒素除具有抗惊厥、抗癫痫和镇痛镇静作用外，尚可用于肿瘤等多种疾病的治疗，目前已分离得蝎毒素约30种。而蝎毒的有效成分是活性蛋白，雄蝎中蛋白质含量相对雌蝎较多，这也正验证了临床中雄蝎药用价值较好的现象。因此，试验结果证实了雌蝎、雄蝎在药用及食用方面确实存在着一定差异。

目前，全蝎在中药材使用过程中并没有将雌雄区别。但是，由于野生全蝎数量减少，大部分全蝎已转由人工养殖提供，养殖户应在养殖过程中将雌蝎、雄蝎分别处理，并对不同目的的食用者给予不同推荐。