核桃种质资源rDNA—ITS序列分析

徐丽　陈新　魏海蓉　张力思　宗晓娟　王甲威　朱东姿　谭钺　刘庆忠

摘要：本研究以9份核桃属种质资源为材料，利用设计引物对其ITS区段进行PCR扩增和测序。利用Dnasp 5.0和MEGA 6.0软件分析ITS序列特征，寻找差异位点，并构建系统发育树。结果显示，9份材料的ITS区段在644～647 bp之间，存在48个变异位点，转换和颠换的比值为1.75。系统发育树结果表明，野核桃和核桃楸亲缘关系最近，最先聚在一起，再与麻核桃聚为核桃楸组，与传统分类学一致。本研究为发掘和利用核桃属种质资源奠定了理论基础。

关键词：核桃属；ITS序列；序列分析

中图分类号：S664.102.4 文献标识号：A 文章编号：1001—4942（2016）03—0001—04

我国是核桃属（Juglans）植物的起源和分布中心之一，核桃种质资源丰富，分布广泛。全世界核桃属植物约有23个种，原产我国的有5个种，即核桃（J.regia L.）、野核桃（J.cathayensis Dode）、核桃楸（J.MANDSHURICA mAXIM.）、麻核桃（J.hopeien-sis Hu）和铁核桃（J.sigllata Dode）。核桃属中多数成员为重要的种质资源，有食用、药用和材用等价值。

近年来，随着分子生物学技术的发展，DNA分子水平的遗传标记被广泛用于解决系统发育、基因资源保护和遗传育种中的问题。其中利用ITS序列及其二级结构阐述核桃属之间的系统进化关系是一种有效的方法。ITS序列是介于18S和28S之间的非编码转录间隔区。在被子植物中，ITS序列长度在500～700 bp之间，而在裸子植物中，ITS序列长度在1500～3700 bp之间。ITS序列进化速度非常快，是在种、属和科水平上构建分子系统发育树的有效工具。ITS1位于18S和5.8S之间，在种及种以下水平非常有价值。ITS2位于5.8S和28S之间，被证明在更高级生物分类学水平上包含有价值的生物学信息。ITS序列可用于了解物种系统发育史和多倍体祖先、基因组同源性、基因渗透和其它进化问题。ITS序列和5.8S rDNA已被成功用于研究核桃属系统发育和生物地理关系。

本研究对9份核桃种质资源的ITS序列进行比较，分析其序列特征，探讨核桃属植物的遗传变异情况及其亲缘关系，为其系统生物学研究提供资料。

1材料与方法

1.1材料

供试核桃种质资源9份，保存在山东泰安国家核桃板栗资源圃，分别为香玲（J.regia L.）、云新（J.sigllata D.×J.regia L.）、核桃楸（J.mandshu-rica Maxim.）、泰山野核桃（J.cathayensis Dode）、狮子头（J.hopeiensis Hu）、鸡心（J.hopeiensis Hu）、小果黑核桃（J.microcarpa Engelm）、北加州黑核桃（J.hindsii）和魁核桃（J.major Heller）。取新鲜叶片液氮速冻后保存于-80℃冰箱备用。

1.2基因组DNA提取

采用植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取各材料总DNA。

1.3 ITS区序列扩增和测序

根据GenBank上发表的核桃属ITS序列设计特异引物，上游引物P1：5′-AAGTCGTAACAAG-GTITCCGTAG-3′和下游引物P2：5′-GCCCGCT-TATFGATATGCTFAAAT-3′。以基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40 s，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，然后用DNA回收试剂盒回收目的片段，连接pBLUE载体，转化E. coliDH5a，筛选阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。

1.4 ITS区序列分析和系统发育树构建

测序结果采用DNAMAN软件校对拼接，然后进行BLASTN（Nucleotide BLAST）比对，确定所获序列。利用MEGA 6.0软件中邻接法（Neighbour-joining method，NJ）构建系统发育树，bootstrap（重复1000次）检验各分支支持率。运用Dnasp5.0进行碱基组成、变异位点数、简约信息位点、转换和颠换数等分析。

2结果与分析

2.1 ITS序列扩增及序列信息

以9份核桃种质资源的基因组DNA为模板，P1和P2为引物，进行PCR扩增。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，在750 bp处出现特异性条带，片段大小与预测值基本一致。对各样品的测序结果进行序列拼接，获得ITS区序列。将测序结果在NCBI上进行BLASTN比对，其核苷酸序列均与核桃属ITS区序列具有较高的相似性，同源性均达到95%以上。HMMer注释法得到9份种质资源以“TTGTCG”为始端、以“GCGAGC”为末端的ITS区序列全长。9份核桃的ITS区序列长度在644～647 bp之涉及，G+C占55.43%～56.57%。其中ITS1序列长263～266 bp，G+C含量为54.55%～55.64%；5.8S rDNA序列长162bp，G+C含量为54.94%；ITS2序列长219 bp，G+C含量为56.62%～59.36%（表1）。公认的核桃科ITS1和ITS2序列之间的G+C含量是稳定的，高GC含量与保持DNA和RNA二级结构特别是茎一环结构的稳定性是相关的。

2.2 ITS序列变异分析

ITSl和ITS2序列变异分析包括转换、颠换、插入和缺失。Dnasp 5.0软件分析显示，9份核桃种质资源ITS序列位点中不变位点数为604，变异位点数为48，多态性位点数（Polymorphic sites）为39，简约信息位点数（Parsimony informative sites）为32。核苷酸多样性（Nucleotide diversity）Pi值为0.02886，Theta值为0.02747，序列之间的一致性达97.60%。ITSl区存在TAA插入、A插入和G缺失，ITS序列转换和颠换的比值为1.75（表2）。

2.3供试核桃种质材料间的遗传距离及系统发育分析

应用MEGA 6.0进行序列分析，根据ITS1-5.8S-ITS2核苷酸序列，运用邻接法（NJ）构建9份核桃种质资源的系统发育树（图1）。结果表明，魁核桃、小果黑核桃和北加州黑核桃聚为一类，香玲和云新聚为一类，而泰山野核桃、核桃楸、狮子头和鸡心聚为一类，与传统分类学一致。3结论与讨论

ITS序列是位于18S-5.8S-28S之间的转录间隔序列，具有高拷贝性。由于其长度的保守性和核苷酸序列的高度变异以及各重复单元间协同进化的特性，ITS已经成为在DNA水平上探讨物种系统进化及进行多样性研究的有效手段。本研究用Dnasp软件分析了9份核桃种质资源的ITS序列及其包含的不变位点、变异位点、多态性位点、简约信息位点等，结果表明不同核桃种质资源的ITS序列存在较多的变异位点，可作为区分核桃种质资源的有效工具。供试核桃种质材料ITS核苷酸多样性的Pi值和Theta值均很低，说明核桃属ITS不存在假基因现象，符合被子植物ITS协同进化规律。

关于野核桃和核桃楸的系统分类地位一直存在争议，《中国植物志》将野核桃和核桃楸定为2个种；《Flora of China》根据两者形态相似性，将野核桃归类到核桃楸中；国外研究者基于形态学与遗传标记的分析支持野核桃与核桃楸为2个种的观点。麻核桃的系统发育地位也一直存在争议，《中国植物志》将麻核桃归为核桃属的核桃楸组；RAPD分子标记对麻核桃系统地位的分析结果显示，核桃楸×核桃的天然杂交是麻核桃形成的主要机制，在麻核桃的起源中，核桃楸的遗传贡献率大于核桃，结果赞成传统分类学对麻核桃分类地位的划分。本研究通过分析9份核桃种质资源的ITS序列构建系统进化树，结果显示，9份材料主要分为两大类，小果黑核桃、北加州黑核桃和魁核桃先聚为一类再与香玲和云新聚为一大类；泰山野核桃与核桃楸先聚为一类，再与麻核桃（狮子头和鸡心）聚为一大类。说明野核桃和核桃楸亲缘关系最近，最先聚在一起。ITS测序结果也显示泰山野核桃和核桃楸存在相同的插入和缺失，两种间有99%的碱基相同，由此可见核桃楸和野核桃之间的亲缘关系的确非常近。本研究结果倾向于认为这两个种是为了适应环境变化而产生的不同地理生态类型。聚类分析还显示野核桃、核桃楸和麻核桃最终聚在一起形成核桃楸组，这与传统分类学一致，也进一步证明核桃楸对麻核桃形成的遗传贡献率大于核桃。