矮牵牛‘漫波红色’再生及遗传转化体系的初步建立

董亚茹 王照红 杜建勋 陈传杰 赵东晓

摘要：以矮牵牛‘漫波红色无菌苗叶片为外植体，建立无菌再生体系，并在此基础上建立其遗传转化体系。结果表明，诱导矮牵牛叶片分化的最佳培养基为Ms+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA；最佳生根培养基为1/2MS+0.1 mg/L NAA；最适出芽和生根的卡那霉素筛选压分别为100 mg/L和20 mg/L；最适头孢霉素抑菌浓度为200 mg/L。

关键词：矮牵牛；漫波红色；再生体系；遗传转化

中图分类号：S681.603.6 文献标识号：A 文章编号：1001—4942（2016）03—0014—04

矮牵牛比较容易再生，组织与细胞操作技术简单，生活周期短，遗传背景清晰，又是一种重要的园林花卉，因而其基因工程育种开展的较早，成为常见的转基因花卉。并在植物基因工程育种、体细胞育种及单倍体育种方面均取得一定进展，基因工程育种已创造出新的矮牵牛品种并加以应用。国内外对矮牵牛组织培养方面的研究已经相当深入，曾进行过叶、茎、节间、叶肉原生质体、花粉粒、根分生组织、茎分生组织、芽、花瓣等外植体类型的研究。常用作矮牵牛组织培养外植体的有种子、带芽茎段、茎尖、叶片、花蕾、花瓣、花药等。

利用生物技术手段改变观赏植物的性状，创造优良新品种，是目前园林植物研究的一个热点。本试验以矮牵牛‘漫波红色为材料，建立其再生体系以及遗传转化体系，为下一步农杆菌介导的转基因研究做好准备工作，也为其他观赏植物的转基因研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

以矮牵牛‘漫波红色无菌苗为材料，取生长一致的无菌苗叶片做为外植体，接种在添加不同激素的MS基本培养基（附加蔗糖30g/L、琼脂7.8g/L，pH 5.8～6.0）中，培养温度为（25±2）℃，光照强度2 000～3 000 lX，光照时间16 h/d。

农杆菌菌株：EHA105；质粒：pROKⅡ，该表达载体含有NptⅡ基因，遗传转化时可通过卡那霉素抗性筛选获得转基因植株。

1.2试验方法

1.2.1愈伤组织的诱导及芽的分化将无菌苗叶片切成5 mm×5 mm的方块接种于添加不同浓度6-BA和不同浓度NAA的MS培养基上，远轴面朝下。6-BA的浓度设为0.5、1.0、1.5、2.0mg/L，NAA的浓度设为0.05、0.1、0.5 mg/L，做正交设计。每处理30个外植体，3次重复，10 d继代一次，30 d后统计叶片分化率及生长情况，选择最佳芽分化培养基。分化率（%）=分化外植体数/外植体总数×100。

1.2.2生根培养切取生长一致的无菌再生壮苗，将其接种在添加不同浓度NAA的1/2MS培养基上。NAA的浓度设为0、0.05、0.1、0.5、1.0mg/L，每处理30个外植体，重复3次，10 d继代一次，30 d后统计生根率及再生不定根的生长情况，选择最佳生根培养基。生根率（%）=生根外植体数/外植体总数×100。

1.2.3卡那霉素选择压的确定①卡那霉素对外植体分化的影响：取矮牵牛无菌苗叶片切成5mm×5 mm大小，分别接种于添加0、25、50、75、100、150 mg/L卡那霉素的MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培养基中分化培养，每处理30个外植体，重复3次，10 d继代一次，20 d后统计分

2.2生根培养

切取1.5 cm左右高的无菌再生苗接到添加不同浓度NAA的1/2MS培养基中，10 d左右时，化率。②卡那霉素对生根的影响：切取生长一致的无菌再生壮苗，分别接种于添加0、5、10、15、20、30 mg/L卡那霉素的1/2MS+0.1 mg/L NAA培养基中，每处理30个外植体，3次重复，10 d继代一次，20 d后统计生根情况。

1.2.4除菌剂头孢霉素浓度的筛选 ①头孢霉素对农杆菌的抑制情况：取适量农杆菌EHA105菌液加入到含有不同浓度除菌剂的LB液体培养基中，设置0、100、200、300、400、500 mg/L头孢霉素浓度梯度，28℃、180 r/min摇床暗培养48 h，测定OD值。②头孢霉素对外植体分化的影响：将矮牵牛无菌叶片切成5 mm×5 mm大小，接种在分别添加0、100、200、300、400、500 mg/L头孢霉素的MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培养基上，每处理30个外植体，重复3次，10 d继代一次，20 d后统计分化结果。

2结果与分析

2.1愈伤组织的诱导及芽的分化

叶片接种5 d后，整体膨大，增厚，并发生卷曲（图1）。一周后在叶片切口边缘开始出现浅绿色的愈伤组织，叶脉处最为明显。两周后愈伤组织体积稍有变大，颜色变绿，在MS+0.5 mg/L6-BA+0.05 mg/L NAA培养基上最先有绿色芽点出现，主要集中在叶脉处。三周后大多数叶片变成黄色，同时一些芽体发育成幼苗。在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培养基上芽的分化率最高，达到86.7%，且芽簇生密集。在1/2MS+0.05 mg/L NAA和1/2MS+0.1 mg/LNAA培养基中最先有锥状白色凸起。NAA在0～1.0 mg/L浓度范围内均能诱导生根，在不添加NAA的培养基中，生出大量的根，但根细、呈黄绿色，NAA浓度越高，生出的根越粗壮，但数量越来越少，且生根率达到一定值后出现下降。在

2.3卡那霉素选择压的确定

2.3.1卡那霉素对外植体分化的影响 卡那霉素在0～75 mg/L浓度范围内，外植体有愈伤组织产生，随着浓度增加，叶盘的愈伤膨大率降低，分化出的芽数也逐渐减少，死亡率依次增加。当卡那霉素浓度为75 mg/L时，外植体分化率为6.7%，而死亡率已达到63.3%；当卡那霉素浓度为100～150 mg/L时，大部分叶片黄化死亡，分化率为零（图3）。因此，将100 mg/L作为卡那霉素抑制假阳性的临界浓度。

2.3.2卡那霉素对生根的影响 在不添加卡那霉素的培养基中，再生苗植株生长正常，生根率达100%；在5～15 mg/L范围内，随着卡那霉素浓度的增加，生根率依次降低，且根系数量较不添加卡那霉素少，植株长势弱；当卡那霉素浓度达到20mg/L时，生根率几乎为零（图4）。因此，在生根筛选时宜选择卡那霉素浓度20 mg/L作为选择压。

2.4头孢霉素浓度的筛选1/2MS+0.1 mg/L NAA培养基中，生根率达100%，且根粗壮、数量多（图2）。因此，1/2MS+0.1 mg/L NAA为矮牵牛生根的最适培养基。

2.4.1头孢霉素对农杆菌的抑制情况将农杆菌菌液加入到含有不同浓度头孢霉素的LB液体培养基中，28℃、180 r/min暗培养48 h，菌的生长受到不同程度的抑制（图5）。当头孢霉素浓度为100 mg/L时，农杆菌繁殖受到一定抑制；当头孢霉素浓度为200～500 mg/L时，农杆菌的OD值均小于0.5，且抑菌效果基本一致。考虑到高浓度的头孢霉素会对外植体生长造成一定影响，因此初步确定200 mg/L为最适的抑菌浓度。

2.4.2头孢霉素对外植体分化的影响 在0～500 mg/L浓度范围内，随着头孢霉素浓度的升高，诱导出的愈伤组织量减少，外植体的分化率也逐渐降低（图6），且分化出的芽生长缓慢，叶片发黄。因此，在转化过程中，在有效抑制农杆菌生长的前提下，头孢霉素浓度应采用一个较低值，以保证矮牵牛叶片能正常诱导分化。由于在200mg/L时头孢霉素就能有效抑制农杆菌生长，所以在共培养结束后，第一次筛选时选用500 mg/L头孢霉素，一周后，在后期培养中选用200 mg/L进行抑菌筛选培养，既可抑制农杆菌生长也不会影响外植体分化。3结论与讨论

本研究以‘漫波红色无菌植株叶片为外植体，成功建立了其无菌再生及遗传转化体系。不同的矮牵牛品种其再生方式存在差异，马方芳等的研究结果表明‘幻想矮牵牛在MS+2.0mg/L6-BA+2.0 mg/L NAA培养基中直接再生出芽率达94.7%，且无明显愈伤。而本研究中‘漫波红色在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA培养基中出芽率最高，且有大量愈伤产生，6-BA在0.5～2.0 mg/L范围内，浓度越高分化率越高，NAA浓度高于或者低于0.1 mg/L都不利于再生芽的产生。组织培养一般选用1/2MS培养基作为生根基础培养基，再添加不同浓度的IBA或者NAA。张树军等在1/2MS培养基中添加0.5 mg/L的NAA，几乎都能诱导出根。马瑛以0.1 mg/L的IBA作为生根激素，生根率也达到100%。本研究采用NAA作为生根激素，0.1 mg/L浓度下的生根率达100%，且植株生长健壮。

有关矮牵牛遗传转化的研究也已有很多报道，但由于再生和遗传转化效率的基因型依赖性强，故不同品种其研究结果也不同。卡那霉素为双子叶植物遗传转化时常用的选择标记用抗生素，对植株再生有很大影响。本研究中，卡那霉素浓度为100 mg/L时才能完全抑制‘漫波红色矮牵牛再生芽的产生，这与冯慧等的试验结果一致。刘南南等用潮霉素进行敏感性试验发现，10 mg/L的潮霉素就能完全抑制‘梦幻系列矮牵牛叶片分化生长。武术杰等用15mg/L卡那霉素便完全抑制了矮牵牛‘Tidal Wave品种再生芽的发生。本研究中，低浓度（20mg/L）的卡那霉素则可以抑制不定根的产生。司爱君等在矮牵牛的遗传转化试验中采用30mg/L的卡那霉素进行生根筛选，对照植株完全不能生根。头孢霉素是植物遗传转化中常用的一种抑菌剂，其使用浓度以完全抑制农杆菌的生长而不影响外植体分化为宜。孙艳香等研究结果显示，300 mg/L头孢霉素为‘交响曲系列矮牵牛遗传转化适宜的抑菌剂。本试验中，200 mg/L头孢霉素就有很好的抑菌效果，在0～500 mg/L范围内，头孢霉素浓度对外植体出芽率的影响差异不大，因此选择200 mg/L为适宜的抑菌浓度。