凡纳滨对虾CTNNBL1基因克隆及表达分析

史黎黎 黎铭 章双

摘要：【目的】明确CTNNBL1基因在凡纳滨对虾抗病过程中的功能作用，为深入探讨对虾抗病免疫机制提供参考依据。【方法】采用RACE-PCR克隆凡纳滨对虾CTNNBL1基因（LvCTNNBL1），利用在线软件进行生物信息学分析，并进一步分析其组织表达特征及应答白斑综合征病毒（WSSV）和副溶血弧菌感染的表达模式。【结果】LvCTNNBL1基因cDNA全长1906 bp，其中开放阅读框（ORF）长1692 bp，编码563个氨基酸，含有1个CTNNBL结构域。同源性分析发现LvCTNNBL1蛋白与大型溞（Daphnia magna）同源蛋白的相似度最高，为77%。基于CTNNBL1基因序列的系统发育进化分析结果显示，凡纳滨对虾被聚为无脊椎动物一类，与同为节肢动物的大型溞、西方蜜蜂（Apis mellifera）和美洲鲎（Limulus polyphemus）的亲缘关系较近。LvCTNNBL1基因在凡纳滨对虾中呈组成型表达，以在肠道中的表达量最高、表皮中的表达量最低。注射感染WSSV后，LvCTNNBL1基因在凡纳滨对虾血细胞中的表达量呈先下降后上升趋势，在所有检测时间点与对照组间存在显著（P<0.05）或極显著（P<0.01，下同）差异；注射感染副溶血弧菌后，LvCTNNBL1基因在凡纳滨对虾血细胞中的表达量呈先上升后下降趋势，感染后12 h内较对照组极显著升高。【结论】LvCTNNBL1基因表达量在病毒和细菌感染时发生明显变化，可能参与了凡纳滨对虾的抗病免疫途径。

关键词： 凡纳滨对虾；CTNNBL1基因；白斑综合征病毒（WSSV）；副溶血弧菌；表达分析

中图分类号： S945.46 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）07-1203-06

0 引言

【研究意义】我国是世界对虾养殖第一大国，养殖的对虾品种有凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）、斑节对虾（Penaeus monodon）和日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）等，其中凡纳滨对虾是最主要的养殖品种（Li and Xiang，2013；曾地刚等，2014）。近年来，以白斑综合征（White spot syndrome，WSS）和急性肝胰腺坏死综合征（Acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）为主的多种病害给我国对虾养殖业带来巨大经济损失，养殖效益大幅度下降（Flegel et al.，2008；张彬等，2015）。因此，借助现代生物学技术开展对虾自身生理抗病机制，尤其是先天性免疫防御机理研究，对于推动我国对虾产业的健康持续发展具有重要意义。【前人研究进展】目前的研究已证实，有多个免疫信号通路在对虾抗病免疫过程中发挥重要功能作用。Zhu和Zhang（2013）研究发现Wnt信号通路参与调节果蝇S2细胞对白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）的吞噬作用；Chen等（2013）对WSSV感染前后凡纳滨对虾肝胰腺转录组进行比较分析，发现Wnt信号通路相关基因在WSSV感染前后的表达量存在显著差异。这些研究结果提示Wnt信号通路可能参与对虾的先天性免疫应答，但具体机理尚需进一步研究验证。Wnt信号转导是一条多环节、多作用位点的关键信号通路，参与机体生长、发育、代谢等生物学过程，而β-链蛋白（β-catenin）是Wnt信号通路的关键作用因子（Kestler and Kühl，2008）。Zhang等（2016）的研究结果表明，凡纳滨对虾β-catenin基因被沉默后，其抗WSSV和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的能力均显著降低，说明β-catenin基因在凡纳滨对虾抗病免疫中可能发挥重要作用。【本研究切入点】CTNNBL1全称为β-catenin like protein 1，其与β-catenin基因编码的蛋白结构相似，在功能上与β-catenin基因亦有关联（Liu et al.，2008），但至今在对虾类物种中未见该基因的相关报道。【拟解决的关键问题】克隆凡纳滨对虾CTNNBL1基因（LvCTNNBL1），并进一步分析其组织表达特征及应答WSSV和副溶血弧菌感染的表达模式，旨在明确CTNNBL1基因在凡納滨对虾抗病过程中的功能作用，为深入探讨对虾抗病免疫机制提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

凡纳滨对虾（8～10 g）购自湛江腾飞实业有限公司，试验前在水族箱循环系统中暂养7 d，使其适应实验室养殖环境。携带WSSV的凡纳滨对虾及副溶血弧菌由广东海洋大学营养与饲料实验室保存提供。RNeasy Mini Kit购自德国Qiagen公司；SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit购自美国Clontech公司；PrimerScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit、LaTaq酶、pMD20-T载体、DH5α感受态细胞、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）购自日本TaKaRa公司；胶回收试剂盒及DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1. 2 LvCTNNBL1基因cDNA全长克隆及测序

根据前期凡纳滨对虾转录组测序结果，获得LvCTNNBL1基因的EST序列，利用Primer Premier 6.0设计5'RACE和3'RACE特异性引物（表1），所有引物均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。参照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit使用说明反转录合成5'RACE和3'RACE所需的cDNA第一链模板，按照说明要求进行PCR扩增。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，62～57 ℃（每循环递减0.5 ℃）30 s，72 ℃ 2 min，进行10个循环；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，进行28个循环；最后72 ℃延伸10 min。RACE扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后与pMD20-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞，阳性克隆经PCR鉴定后送至英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序。

1. 3 LvCTNNBL1基因序列生物信息学分析

在NCBI网站上对测序所得结果进行载体序列去除和拼接，然后进行序列比对，利用EditSeq进行开放阅读框（ORF）预测和氨基酸序列翻译，并对蛋白质功能结构域等信息进行预测。在NCBI的Protein BLAST数据库中搜寻具有较高同源性的CTNNBL1蛋白质序列，采用Clustal X进行多序列比对和聚类分析，再以Neighbour-Joining构建系统发育进化树。

1. 4 LvCTNNBL1基因组织表达分析

凡纳滨对虾暂养1周后，随机捕捞15尾，每5尾为一组，分别采集血细胞、肝胰腺、鳃、眼柄、肌肉、表皮、胃、肠、后盲囊、神经和心脏等11个组织样品，置于RNAlater中，室温下放置1 h或4 ℃过夜后转移至-80 ℃下保存。样品总RNA的提取使用RNeasy Mini Kit试剂盒，并采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒合成熒光定量PCR所需的cDNA模板。参照SYBR Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）說明，对不同组织中LvCTNNBL1基因的表达情况进行定量分析，以延伸因子1α（EF1α，GenBank序列号GU136229）基因作内参基因，所用引物序列见表1；扩增程序：95 ℃预变性30 s；94 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，78 ℃ 5 s，进行40个循环。RT-PCR检测结果采用2-△△Ct进行分析。

1. 5 LvCTNNBL1基因应答WSSV及副溶血弧菌感染的表达分析

WSSV悬液制备及副溶血弧菌培养鉴定分别参照Melena等（2015）和Balcázar等（2007）的方法。将凡纳滨对虾分为3组，每组80尾，分别注射WSSV悬液（106拷贝/g）、副溶血弧菌菌液（5.5×106 CFU/g）及PBS（对照），注射0、4、8、12、24、48和72 h后采集凡纳滨对虾血细胞，每3尾对虾为一个混合样品，每组同一个时间点取3个平行，RT-PCR检测LvCTNNBL1基因的表达情况，检测结果经2-△△Ct分析后采用t 检验分析组间差异性。

2 结果与分析

2. 1 LvCTNNBL1基因cDNA全长及序列分析结果

LvCTNNBL1基因（GenBank注册号KX058563）全长cDNA 1906 bp，包含127 bp的5'端非编码区（5'UTR）、1692 bp的ORF区及87 bp的3'端非编码区（3'UTR），编码的蛋白序列含563个氨基酸，预测分子量63.87 ku，等电点5.01（图1）。SMART分析结果显示，LvCTNNBL1氨基酸序列含有1个CTNNBL保守结构域（残基65～ 170）（图2）。

2. 2 LvCTNNBL1蛋白多重序列比对分析结果

不同物种间的CTNNBL1蛋白保守性较强。经同源性分析，发现LvCTNNBL1蛋白与其他物种CTNNBL1蛋白间的相似度较接近，相似性在72%～77%，其中与大型溞（Daphnia magna）CTNNBL1蛋白的相似性最高，为77%（图3）。利用MEGA 5.0进行系统发育进化分析，结果显示，LvCTNNBL1基因与多种无脊椎动物CTNNBL基因聚为一类，与同为节肢动物的大型溞、西方蜜蜂（Apis mellifera）和美洲鲎（Limulus polyphemus）的亲缘关系较近（图4）。

2. 3 LvCTNNBL1基因的组织表达分析结果

采用RT-PCR对不同组织中LvCTNNBL1基因的表达情况进行检测，结果（图5）显示，LvCTNNBL1基因在凡纳滨对虾被检测的11种组织中均有表达，以在神经、血细胞、心脏、鳃、肝胰腺、胃及肠道中的表达量较高，在表皮、后盲囊、肌肉和眼柄中的表达量较低，其中在肠道中的表达量最高，约是眼柄中的74.32倍。

2. 4 LvCTNNBL1基因应答WSSV感染的表达变化特征

注射感染WSSV后，凡纳滨对虾血细胞中LvCTNNBL1基因的表达量呈先下降后上升趋势（图6），在所有检测时间点，该基因的表达量与对照组间存在显著（P<0.05，下同）或极显著（P<0.01，下同）差异。在注射感染WSSV后4、8和12 h，凡纳滨对虾血细胞中LvCTNNBL1基因的表达量明显低于对照组，并于注射后12 h达最低值，仅为对照组的57%；在注射感染WSSV后24、48和72 h，凡纳滨对虾血细胞中LvCTNNBL1基因的表达量极显著高于对照组，并于注射后72 h达最大值，为对照组的3.04倍。

2. 5 LvCTNNBL1基因应答副溶血弧菌感染的表达变化特征

由图7可以看出，注射感染副溶血弧菌后4 h，凡纳滨对虾血细胞中LvCTNNBL1基因的表达量较对照组极显著升高，在注射感染后8 h达最大值，为对照组的1.89倍；在注射感染24 h后，凡纳滨对虾血细胞中LvCTNNBL1基因的表达量又降至与对照组相当的水平，二者间无显著差异（P>0.05）。

3 讨论

CTNNBL1基因最早在人类细胞凋亡过程中被认识（Jabbour et al.，2003），随后的研究发现其多态性与人类肥胖及记忆密切相关（Liu et al.，2008；Papassotiropoulos et al.，2013）。本研究从凡纳滨对虾中克隆获得CTNNBL1基因，并发现其在应答病原感染时的表达量产生显著变化，提示LvCTNNBL1基因可能参与凡纳滨对虾抗病免疫。LvCTNNBL1基因编码的蛋白包含一个CTNNBL结构域，与已报道的其他物种CTNNBL1蛋白结构一致（Chandra et al.，2013）。经系统发育进化树分析，发现CTNNBL1基因被分为脊椎动物和无脊椎动物两组，凡纳滨对虾与多种无脊椎动物聚集在一个分支上，且与同为节肢动物的大型溞、西方蜜蜂和美洲鲎亲缘关系较近，说明在不同动物中CTNNBL1基因进化相对保守。

雖然目前已在多个物种中发现CTNNBL1基因，但绝大多数是通过高通量测序手段進行鉴定，仅掌握相关序列的信息，缺乏深入研究，有关其表达及功能的信息主要集中在人类。与人类相似，LvCTNNBL1基因在凡纳滨对虾中也呈组成型表达，不具有组织特异性，但在不同组织中的表达量存在明显差异。在人类中，CTNNBL1基因在骨骼肌、胎盘、心脏、肾脏、睾丸及甲状腺中表达量尤其高（Jabbour et al.，2003），而在凡纳滨对虾中，LvCTNNBL1基因在肠道、胃、肝胰腺、鳃、心脏、血细胞及神经中表达量较高。可见，不同物种中CTNNBL1基因的表达模式存在较大差异，可能与物种的特异性相关。此外，作为β-catenin基因的类似物，CTNNBL1基因在凡纳滨对虾中的表达模式与其比较相似，在肠道、鳃、血细胞及神经组织中的表达量均较高（Zhang et al.，2016），提示CTNNBL1基因可能与β-catenin基因具有相似的功能。

在凡纳滨对虾的相关研究中已发现，Wnt信号通路的关键因子β-catenin基因被沉默后增强了机体应答WSSV和副溶血弧菌感染的易感性，即β-catenin基因在凡纳滨对虾抗细菌和病毒感染的过程中发挥了积极作用（Chen et al.，2013；Zhang et al.，2016）。本研究结果显示，在应答WSSV和副溶血弧菌感染过程中，凡纳滨对虾血细胞中LvCTNNBL1基因的表达量均产生显著变化，提示LvCTNNBL1基因可能也参与了凡纳滨对虾抗病免疫，具体原因可能与β-catenin基因类似有关，但相关作用机制有待深入研究。本研究中，β-catenin基因在凡纳滨对虾感染WSSV后24 h内的表达量显著低于对照组，可能与对虾处于WSSV潜伏期有关；而在感染24 h后β-catenin基因表达量极显著升高，推测WSSV潜伏期已过，β-catenin基因通过正向调控来抵御病毒。相比之下，副溶血弧菌感染后4 h，凡纳滨对虾β-catenin基因表达量极显著升高，提示细菌感染后β-catenin基因即发挥正向调控作用。

4 结论

本研究结果表明，LvCTNNBL1基因表达量在病毒和细菌感染时发生明显变化，提示CTNNBL1基因可能参与了凡纳滨对虾的抗病免疫途径。

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（責任編辑 兰宗宝）