广西崇左市山黄皮种质资源调查及ISSR遗传多样性分析

覃振师 邓立宝 王文林 陈海生 谭德锦 黄锡云 汤秀华

摘要：【目的】分析广西崇左市山黄皮种质资源的遗传多样性，为山黄皮资源的分类、鉴定、保护和开发利用提供理论依据。【方法】调查和收集广西崇左市龙州县、宁明县、凭祥市、江州区、天等县、扶绥县和大新县7个县（市、区）的山黄皮种质资源，并进行ISSR-PCR扩增、聚类分析和主成分分析。【结果】15条多态性ISSR引物可从50份山黄皮种质资源中扩增出136条带，多态性条带比例为55.15%；各山黄皮种质间的相似系数在0.769～0.942，平均0.875。聚类分析结果显示，ISSR分子标记能将供试材料完全区分，在遗传相似系数0.864处，可将50份山黄皮种质资源聚为A、B两大组，其中A组包括来自龙州县、宁明县、凭祥市、江州区和扶绥县的40份种质，B组包括来自天等县和大新县的10份种质。主成分分析结果表明，前三主成分贡献率依次为12.11%、8.73%和7.68%，累积贡献率为28.52%；主成分分析可将50份山黄皮种质资源分为两大类，与聚类分析结果基本一致。【结论】广西崇左市山黄皮种质资源较丰富，大部分山黄皮种质亲缘关系较接近，且与地理起源有一定的相关性，NM9、TD1、DX2和JZ5等遗传差异较大的种质可作为山黄皮优良品种和单株选育及良种繁育等研究的重要材料。

关键词： 山黄皮；种质资源；ISSR；广西崇左市

中图分类号： S663.9 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）07-1071-06

0 引言

【研究意义】山黄皮[Clausena indica （Dalz.） Oliv]俗称鸡皮果，为芸香科柑桔亚科黄皮属（Clausena）多年生常绿大灌木或小乔木，其果实和树叶均具有特殊香味，果皮、核、根可入药，是优良调味佳品，且具有生津止渴的功效，其用途广泛，经济价值高（黄峰等，2005；梁立娟等，2011）。山黄皮主要分布于南亚热带地区的中国、越南、菲律宾等国家，在我国主要分布于广西西南部、云南南部、广东新会等地（蓝庆江等，2008；覃振师等，2012）。广西崇左市是我国最重要的山黄皮产区之一，资源丰富，分布范围广，但其山黄皮研究基础薄弱，缺乏系统调查资料和遗传多样性信息，山黄皮品种分类较混淆，主观性大，仍存在同物异名和同名异物的现象，影响了山黄皮种质资源的开发、利用和保护。因此，调查广西崇左市山黄皮种质资源并研究其遗传多样性，对制定山黄皮产业发展规划、开展科学研究和指导生产具有重要意义。【前人研究进展】近年来，分子标记技术被广泛应用于黄皮属种质资源研究。刘小梅等（2007）对影响RAPD-PCR扩增的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度及退火温度等因素进行优化，建立了黄皮RAPD-PCR反应体系。蒋素梅等（2008）采用RAPD分子标记技术对广东、广西广泛栽培的14个黄皮品种进行遗传多样性分析，将供试黄皮品种（系）划分为3个类群，与形态分类有一定的相似性，基本反映了黄皮品种间的遗传多样性。李开拓等（2009a，2009b）对ISSR-PCR反应中的主要影响因子进行单因素和正交试验，建立了适宜黄皮ISSR分析的扩增体系；并采用ISSR分子标记技术对40个黄皮品种的遗传多样性进行分析，将供试黄皮材料分为5组，与形态学具有一定的相关性，但比形态分类更严格，在风味、种子等方面分类重复少。Zhao等（2010）从100个RAPD引物中筛选出1个与无核基因相连锁的引物，可用于有效鉴定杂交種群体中的无核黄皮。【本研究切入点】前人对黄皮属种质资源遗传多样性的研究主要集中在黄皮栽培品种和育种材料，目前有关山黄皮种质资源遗传多样性的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过查阅相关资料、走访专家、实地调查和生物学鉴定，对广西崇左市山黄皮种质资源进行调查研究，并以简单重复序列分子标记（ISSR）对其进行遗传多样性分析，为山黄皮种质资源的分类鉴定、优良品种培育和资源保护提供理论基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为从崇左市龙州县、宁明县、凭祥市、江州区、天等县、扶绥县和大新县7个县（市、区）收集的50份山黄皮种质资源（表1）。聚乙烯吡咯烷酮（CTAB）、DNA Marker、dNTPs、Tris-HCl等试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司，Taq DNA聚合酶购自上海英骏生物技术有限公司。采用的引物参照加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的引物序列进行设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 DNA提取 采用改良的SDS法（陈国平等，2011）提取山黄皮葉片DNA，用紫外分光光度计和1.0%

琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，将各样品的总DNA稀释至30 ng/μL。

1. 2. 2 引物筛选 用3个遗传差异较大的山黄皮DNA样品对合成的ISSR引物进行筛选，选取多态性好、扩增产物条带清晰的15条引物用于所有DNA样品扩增。

1. 2. 3 PCR扩增 在Biometra Tprofessional PCR仪上进行ISSR-PCR扩增，反应体系20.0 μL：模板DNA 1.0 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.0 μL，4.0 mmol/L dNTPs 0.5 μL，30 μmol/L引物1.0 μL，0.40 U DNA聚合酶0.5 μL，加ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，复性退火（温度随引物而定）1 min，72 ℃ 2 min，进行35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1. 3 数据处理

根据分子标记的迁移率及其有无，统计每个样品的扩增电泳谱带，构建“0、1”二元数据矩阵，采用NTsys 2.10计算遗传相似性系数。在遗传相似系数矩阵的基础上进行主成分分析和聚类分析，绘制树状聚类图。

2 结果与分析

2. 1 ISSR标记检测结果

筛选到15条多态性ISSR引物，并对50份山黄皮种质资源进行扩增，共扩增出136条带，其中多态性条带75条，多态性比例为55.15%，说明供试样品的遗传多样性较低。每条引物可扩增出6～15条带，平均9.01条；产物条带介于250～2200 bp，以400～1500 bp居多（图1和表2）。

2. 2 相似系数分析结果

用NTsys 2.10计算出15条ISSR引物扩增结果在不同种质间的相似系数，平均遗传相似性系数为0.875。DX2与JZ5的相似系数最小，为0.769，与两者果形及其他表型性状上存在较大差异相吻合；TD1与TD4的相似系数最大，为0.942，两者在形态上较相似。

2. 3 聚类分析结果

用UPGMA构建50份山黄皮种质的分子系统树（图2），从聚类分析图可以看出，不同山黄皮种质间的亲缘关系较复杂。在相似系数0.864处，可将50份山黄皮种质分成A、B两大组。A组包含40份种质，可分2个亚组：第I亚组包含28份种质，其中16份种质来自龙州县，7份种质来自宁明县，5份种质来自凭祥市；第II亚组包含12份种质，其中6份种质来自江州区，4份种质来自扶绥县，2份种质来自宁明县。B组包含10份种质，可分2个亚组：第I亚组包含8份种质，其中4份种质来自天等县，4份种质来自大新县；第II亚组包含2份种质，均来自大新县。

2. 4 主成分分析结果

应用NTsys 2.10在遗传相似系数矩阵基础上对50份山黄皮种质资源进行主成分分析，前三主成分贡献率依次为12.11%、8.73%和7.68%，累积贡献率为28.52%，可以代表原始数据的主要信息。从二维聚类图（图3）可看出，50份山黄皮种质可分为A、B两个群体，与聚类分析结果基本一致；供试山黄皮种质占的空间较小，分布较均匀，表明其遗传背景较狭窄，遗传基础较一致。

3 讨论

崇左市位于广西西南部，地跨东经106°33′～108°6′、北纬21°36′～23°22′，地形以山地为主，海拔在79.4～1358.0 m，其山黄皮种质资源丰富，很多地方仍保存着野生居群。黄皮属有30多个种，黄皮和山黄皮是其中的两个栽培种（李开拓，2008；刘冰浩等，2014）。目前对黄皮属的遗传多样性研究多为黄皮栽培种，而关于山黄皮遗传多样性的研究鲜见报道。姜燕等（2005）对黄皮和山黄皮的染色体进行分析，发现这两个种均为二倍体，染色体数目为18，核型類型相同，亲缘关系较接近。王惠君等（2015）对24份广西黄皮种质资源进行分析，在遗传相似系数0.718处将黄皮种质分为三大组，第Ⅰ和第Ⅱ组为黄皮种的不同品种，第Ⅲ组为山黄皮种，山黄皮种和黄皮种间的最小遗传相似系数为0.660。也有研究结果表明，黄皮种的不同品种间亲缘关系较近，如刘小梅等（2007）对36个黄皮基因组DNA进行RAPD扩增，结果表明，大多数黄皮种质相似系数在0.90～0.97，亲缘关系较近；蒋素梅等（2008）对14个黄皮品种（系）进行RAPD分析，结果表明，大多数黄皮品种（系）间遗传差异较小，遗传距离为0.025～0.300，遗传基础较狭窄；李开拓等（2009b）采用ISSR分子标记技术对40份黄皮种质进行遗传多样性分析，结果表明，供试的黄皮品种间平均遗传相似系数高达0.841，遗传多样性很低。本研究采用ISSR分子标记可将供试的50份山黄皮种质资源区分开，从ISSR分析获得的遗传相似系数来看，大部分山黄皮种质相似系数在0.860以上，遗传相似性较大，亲缘关系也较近，说明供试的山黄皮种质遗传多样性较低，可能与取材范围较狭窄有关。

本研究中，来自崇左市北部的大新县和天等县的山黄皮种质被归到一组，来自龙州县、宁明县、江州区、凭祥市、扶绥县的种质被归到另一组；来自崇左市西南部的龙州县、宁明县和凭祥市的种质被归到同一亚组，来自崇左市中部的江州区和东部的扶绥县的种质被归到同一亚组，说明山黄皮种质资源的亲缘关系与地理起源有一定的相关性。桂研20号与来自龙州县、宁明县和凭祥市的种质亲缘关系比较接近，可能与品种选育的亲本来源较近和山黄皮资源的基因交流有关。有少量的山黄皮种质间存在较大的遗传差异，如DX2和JZ5的遗传距离为0.769，NM9和TD1的遗传距离为0.788，其在果形、叶形等表型性状上也存在较明显差异。因此，这些在形态和遗传上差异较大的种质可作为山黄皮单株选育、良种繁育等研究的重要材料。

4 结论

本研究结果表明，广西崇左市山黄皮种质资源较丰富，大部分山黄皮种质亲缘关系较接近，且与地理起源有一定的相关性，NM9、TD1、DX2和JZ5等遗传差异较大的种质可作为山黄皮优良品种和单株选育及良种繁育等研究的重要材料。

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（责任编辑 罗 丽）