N-3不饱和脂肪酸对C57BL/6 PD-1基因敲除小鼠心房结构重构的影响

付国强， 曹义战， 何乾锋， 田小溪， 王伯良(第四军医大学唐都医院急诊科,西安　710038； 通讯作者，E-mail: wliang@fmmu.edu.cn)



N-3不饱和脂肪酸对C57BL/6 PD-1基因敲除小鼠心房结构重构的影响

付国强， 曹义战， 何乾锋， 田小溪， 王伯良*(第四军医大学唐都医院急诊科,西安710038；*通讯作者，E-mail: wliang@fmmu.edu.cn)

摘要：目的观察N-3不饱和脂肪酸饲养对C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房细胞氧化应激水平变化及心房结构重构的影响。方法流式细胞仪检测心房肌细胞活性氧，比较C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠和、N-3不饱和脂肪酸饲养的C57BL/6-PD-1-/-小鼠(每组10只，雄性，6-8周龄)的心房肌细胞氧化应激水平，Masson染色检测心房肌纤维化水平，电子天平称重检测心脏/体质量比值变化。结果与C57BL/6小鼠比较，C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌细胞细胞内活性氧水平明显升高(P<0.05)，心房肌Masson染色显示基因敲除后心房肌出现了明显纤维化、心脏/体质量比值明显升高(P<0.001)，N-3不饱和脂肪酸饲养后的C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌细胞内活性氧水平(P<0.05)及心房肌纤维化、心脏/体质量比值(P<0.01)升高趋势得到明显遏制。结论PD-1基因敲除C57BL/6小鼠的心房肌细胞活性氧水平升高，同时出现了的心房结构重构，N-3不饱和脂肪酸饲养能够遏制这种变化趋势。

关键词：PD-1基因敲除；N-3不饱和脂肪酸；活性氧；心房结构重构；心房纤颤

心房颤动(房颤)是临床上最常见并且危害严重的心律失常疾病，普通人群的发病率约为2%，且随着年龄的增长发病率迅速升高，与非房颤患者相比，房颤患者死亡率及心血管病事件风险明显升高[1]。房颤的发病机制比较复杂，目前普遍认为房颤起源于存在于心房的多发折返环[2]，但对于多发折返环的产生机制仍然未得到完全阐明。近年来，有研究证实心房结构重构能够促进心房内多发折返环生成而使得房颤发病易感性增高[3]。

程序性死亡因子-1(programmed death-1，PD-1)是T细胞表面的CD28家族的一个重要的负性共刺激分子，PD-1基因的缺失或PD-1及其配体途径阻断可以增强T细胞活性，提高体内的炎症水平[4]。氧化应激主要指在细胞代谢过程中所产生的对机体具有损害作用的活性氧(reactive oxygen species，ROS)。在许多病理生理学条件下，炎症可以加强氧化应激水平，反之亦然。已有研究表明，炎症和氧化应激与心房结构重构密切相关[5]。

那么，伴随着PD-1-/-小鼠机体的高炎症状态是否会影响小鼠心房肌细胞氧化应激水平，并进而对小鼠心房结构重构产生影响？本研究应用抗炎药物N-3不饱和脂肪酸饲料添加，对比了C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠和N-3不饱和脂肪酸饲养的C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌氧化应激水平和心房心肌纤维化水平，心脏/体质量比值变化，旨在探究炎症、氧化应激与心房结构重构之间的关系。

1材料和方法

1.1主要仪器及试剂

主要仪器：BD FACScalibur流式细胞仪(美国BD公司)，Langendorff 离体灌注仪(美国 Radnoti 公司)，石蜡切片机，电子天平(美国Sartorius公司)

主要试剂：二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA，美国Sigma-Aldrich 公司)，牛血清白蛋白、无血清培养基、胶原酶Ⅰ、胰蛋白酶 (美国 Sigma 公司)。

1.2实验动物

C57BL/6-PD-1-/-小鼠由日本京都大学的Tasuku Honjo教授免费转让，实验小鼠分为3组：C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠和、N-3不饱和脂肪酸饲养的C57BL/6-PD-1-/-小鼠，每组10只，雄性，6-8周龄。实验前均饲养于第四军医大学基础部神经生物教研室SPF级实验动物中心。实验开始前4周，N-3不饱和脂肪酸饲养的C57BL/6-PD-1-/-小鼠，每只小鼠饲料中添加二十碳五烯酸+二十二碳六烯酸(EPA+DHA),各2.5 mg/d。

1.3血清不饱和脂肪酸浓度检测

参考相关文献中的方法[6]，通过气相色谱法检测血清不饱和脂肪酸浓度，在内标准磷脂酰胆碱存在的情况下提取血清中的脂类物质，然后利用薄层色谱法从血清中性脂质中分离提取磷脂质，最后在磷脂质中提取甲基脂肪酸类脂质并在液相色谱仪上进行分析。

1.4Langendorff小鼠离体心脏灌注获取心房肌细胞

脱颈处死小鼠后迅速摘除心脏并主动脉插管，悬挂于Langendorff离体灌注仪上，通过主动脉实现冠状动脉逆灌注，在冠状动脉灌注过程中保持灌注液温度在37 ℃并加入100%的氧气。最初用普通的台氏液灌注心脏清洗血液，然后用无钙台氏液灌注2 min，最后心脏用0.14 mg/ml胶原酶(Sigma-Aldrich)液灌注15 min左右。灌注结束后，分离心房并剪成碎片，用玻璃移液管吹散这些碎片形成单个细胞。800 r/min离心5 min，将细胞沉淀与含10%胎牛血清的DMEM 培养基混匀，成纤维细胞差速贴壁1 h，更换培养基，无菌无毒条件下，置37 ℃二氧化碳培养箱培养以备后续试验。

1.5心房肌细胞活性氧(ROS)检测

取培养24 h的心房肌细胞，用0.1%胰酶1 ml滴于培养瓶，覆盖瓶底，当细胞开始收缩弃去胰酶，PBS温和清洗1次，放入2 ml无血清培养基，用弯头吸管反复吹打，制备单个细胞悬液。心房肌细胞用无血清培养基清洗2次，种植于96孔培养板，调整细胞浓度至106/ml，加用DMSO配置的浓度为2 μmol/L的二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)0.5 ml，并在37 ℃培养箱中避光孵育20 min，移入上样管上流式细胞仪记录数据。DCF的激发波长为495 nm，发射波长为525 nm，通过FL1检测。

1.6心脏/体质量比值测定及病理学检查

实验小鼠颈椎脱臼处死后用电子天平称量体质量(BW)后，迅速将心脏取出，PBS液中去除结缔组织及残血，滤纸吸干心脏表面残留液体，用电子天平称心脏质量(HW)，计算心脏/体质量比值(HW/BW)。然后将右心房剪下，标本放入Bouin氏液中固定，供组织病理学检查使用。常规石蜡包埋、切片。切片在Masson三色染色液(第四军医大学基础部病理学实验室)中浸入5 min，0.2%醋酸清洗10 s后用5%磷钨酸处理10 min，然后用0.2%醋酸溶液再清洗2次，2%苯胺蓝溶液染色5 min，醋酸清洗2次后梯度酒精脱水，二甲苯清洗中性树胶封片。

1.7统计学分析

2结果

2.1血清不饱和脂肪酸浓度比较

与C57BL/6组比较，血清不饱和脂肪酸浓度在C57BL/6-PD-1-/-小鼠组未见明显升高，但经过4周N-3不饱和脂肪酸喂养后，PUFAs组血清不饱和脂肪酸浓度较C57BL/6-PD-1-/-组明显升高，差异具有统计学意义(P<0.001，见表1)。

表1三组实验动物血清不饱和脂肪酸浓度比较 (%)

Table 1Concentrations of N-3 fatty acids in plasma phospholipids in three groups (%)

小鼠种类 N-3PUFAsEPA+DHAC57BJ65.7±0.63.1±0.6C57BL/6-PD-1-/-5.8±0.73.2±0.7N-3PUFA-C57BL/6-PD-1-/-8.2±0.9*5.7±1.0*

与C57BL/6-PD-1-/-小鼠比较，*P<0.001

2.2心房肌细胞氧化应激水平检测

通过流式细胞仪检测心房肌细胞(每组10 000个)内活性氧结果显示，C57BL/6-PD-1-/-小鼠较C57BL/6小鼠心房肌细胞平均荧光强度明显升高(30.29±2.26vs25.02±1.02，P<0.05)；饲喂N-3 PUFA的C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌细胞平均荧光强度较未饲喂组明显下降(27.20±1.71vs30.29±2.26，P<0.05)，差异具有统计学意义。

2.3HW/BW比值比较

C57BL/6-PD-1-/-小鼠和C57BL/6小鼠比较，HW/BW比值明显升高[(5.469±0.098)mg/gvs(5.145±0.089)mg/g，P<0.001]，饲喂N-3 PUFA的C57BL/6-PD-1-/-小鼠HW/BW比值上升得到较明显的抑制[(5.328±0.101)mg/gvs(5.469±0.098)mg/g，P<0.01]。

2.4心房病理学检查

心房肌Masson三色染色发现，在C57BL/6-PD-1-/-小鼠组出现了比较严重的心肌纤维化，而C57BL/6小鼠组未发现，饲料添加PUFA的C57BL/6-PD-1-/-小鼠心肌纤维化程度有较明显的下降趋势。在C57BL/6-PD-1-/-小鼠组中可以看到大量染为蓝色的胶原纤维，成团块状分布。而C57BL/6小鼠组心肌组织中中没有看到胶原纤维，相对C57BL/6-PD-1-/-小鼠组，PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠组的心肌纤维化程度得到了较明显的抑制。表现在染为蓝色的胶原纤维明显减少，呈现条索状，且数量明显减少(见图3)。

图1　三种小鼠及N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠心脏大体比较Figure 1　Comparison of gross of heart among three groups

图2　C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠及N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠HW/BW比值比较Figure 2　Comparison of HW/BW ratio among three groups

A.C57BL/6小鼠(×200)；B.C57BL/6-PD-1-/-小鼠(×200)；C.N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠(×200)；D. C57BL/6小鼠(×400)；E.C57BL/6-PD-1-/-小鼠(×400)；F.N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠(×400)图3　C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠及N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠心肌纤维化程度比较Figure 3　Comparison of atrial myocardial fibrosis among three groups

3讨论

程序性死亡因子-1(programmed death-1，PD-1)是T细胞表面的CD28家族的一个重要的负性共刺激分子，它通过和其配体程序性死亡因子配体-1/2(programmed death ligand-1/2,PD-L1/2)结合后负性调节免疫反应[7]。敲除该基因能够增强T细胞活性，提高体内的炎症水平。1998年有学者[8]成功制作出了PD-1基因敲除(PD-1-/-)小鼠，有研究证实PD-1-/-小鼠分泌炎性因子的能力明显增强[9]。氧化应激是指机体内氧化和抗氧化失衡，导致某些自由基的产生和抗氧化防御之间出现严重失衡的一种病理状态。在许多病理生理情况下，炎症和氧化应激密切相关，高炎症水平往往伴随着高氧化应激水平。研究表明炎症因子可以通过白细胞膜上NADPH氧化酶复合物的氧化作用产生活性氧，放大氧化应激的反应[10]；炎性细胞因子(IL-6，TNF-a)可直接诱导中性粒细胞产生大量氧自由基[11]，提高机体氧化应激水平，而氧自由基又可以进一步刺激炎症细胞活化。因此，氧化应激和炎症反应形成螺旋上升式的恶性循环。本研究结果显示：C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌细胞氧化应激水平明显升高，表明PD-1基因敲除小鼠本身伴随的高炎症状态影响了小鼠心房肌细胞的氧化应激水平，使其明显升高。同时观察到PD-1基因敲除小鼠出现了明显的心房肌纤维化和心脏/体质量比值增加，即出现了心肌结构重构。

炎症、氧化应激和心房结构重构密切相关，研究表明：心房颤动患者的心房组织中通常存在炎症细胞浸润和炎症因子高表达[12]；氧化应激主要产物是对机体具有损害作用ROS，ROS在血管紧张素Ⅱ所诱导的心肌重构中发挥了重要作用[12]；Ras相关的C3肉毒素底物1(ras related C3 botulinum toxin substrsye 1，Rac1)蛋白能够通过激活氧化应激反应促进心房纤维化及心肌细胞肥大[14]。因此C57BL/6-PD-1-/-小鼠体内高炎症状态和心房肌细胞氧化应激水平升高可能导致了心房肌纤维化和心脏/体质量比值增加。

饲料添加N-3不饱和脂肪酸(PUFAs)能够降低实验动物体内系统性炎症水平[15]。PUFAs主要包括两个基本类型：N-6和 N-3，其中N-3 PUFAs人体不能合成，必须依靠食物摄取。N-3 PUFAs主要有三类：来源于植物的α-亚油酸(LNA:alpha-linolenic acid)，主要来源于海洋脊柱动物类和鱼油中的十二碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)以及二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)。本实验应用DHA和EPA饲料添加补充N-3 PUFAs。结果显示： N-3多聚不饱和脂肪酸饲料添加能够通过其抗炎效应对C57BL/6-PD-1-/-小鼠心肌重构发挥了一定的抑制作用，表现在心肌纤维化程度、心脏/体质量比值上升均得到了一定的抑制。由于N-3多聚不饱和脂肪酸具有确切的抗炎效果，研究结果提示炎症和氧化应激水平升高可能导致了C57BL/6-PD-1-/-小鼠心肌结构重构。由于心房重构和房颤发生发展密切相关，实验结果也高度提示饲料添加N-3多聚不饱和脂肪酸能够降低炎症所导致的房颤发病易感性，对于房颤具有一定的预防作用。

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Effects of N-3 polyunsaturated fatty acids on atrial structure remodeling by inhibiting atrial myocytes oxidative stress in C57BL/6 PD-1-/-mice

FU Guoqiang, CAO Yizhan, HE Qianfeng, TIAN Xiaoxi, WANG Boliang*

(DepartmentofEmergency,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China；*Correspondingauthor,E-mail:wliang@fmmu.edu.cn)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of dietary N-3 polyunsaturated fatty acids(PUFA) supplementation on the oxidative stress level and atrial structure remodeling in PD-1 deficient mice.MethodsThe level of cardiac atrium myocytes oxidative stress, heart weight/body weight(HW/BW)ratio and atrial myocardial fibrosis level were examined in male C57BL/6 mice(n=10), C57BL/6-PD-1-/-mice(n=10) and PUFA-C57BL/6-PD-1-/-mice(n=10). ResultsThe level of atrium myocytes oxidative stress and the HW/BW ratio in C57BL/6-PD-1-/-group were significantly higher than in C57BL/6 group(P<0.05 or P<0.001). The atrial myocardial fibrosis was detected in C57BL/6-PD-1-/-group but not in C57BL/6 group. After dietary N-3 PUFA supplementation, the level of atrium myocytes oxidative stress, HW/BW ratio and atrial myocardial fibrosis were dramatically attenuated in PUFA-C57BL/6-PD-1-/-group(P<0.05). ConclusionThe higher level of atrium myocytes oxidative stress in the C57BL/6PD-1-/-mice results in the atrial structural remodeling. Dietary N-3 PUFA supplementation can attenuate the atrial structure remodeling.

Key words:PD-1 deficiency;N-3 polyunsaturated fatty acids;reactive oxygen species;atrial structure remodeling;atrial fibrillation

[收稿日期：2015-11-04]

作者简介：付国强，男，1976-09生，博士，主治医师,讲师，E-mail:fgq229@yeah.net.

中图分类号：R363

文献标志码：A

文章编号：1007-6611(2016)01-0001-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.001

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81070161)